摘 要： 微流控芯片是近年发展起来的一种全新的微量分析技术, 可将样本前处理、分离检测等多个步骤集合在一起, 使不连续的分析过程连续化、集成化、自动化、微型化, 具备分析剂量小、速度快、成本低、易于集成开发等独特优势, 已应用于生命科学研究、环境科学、病原微生物检测、临床体外诊断等领域。本文着重介绍了微流控芯片在各领域的应用和最新研究进展。
关键词： 微流控芯片; 基因芯片; 病原体;
Abstract： Microfluidic chip is a new microanalysis technique developed in recent years. It combines multiple steps such as sample preprocessing, separation and detection, which made the discontinuous analysis process continuous, integrated, automatic, and miniaturized. The microfluidic chip has the unique advantages of low analysis dose, high reaction speed, low cost and easy integrated development, and has been applied in the fields of life science research, environmental science, pathogenic microorganism detection, clinical in vitro diagnosis and so on. This paper mainly introduced the application of microfluidic chip in various fields and the latest research progress.
Keyword： Microfluidic chip; Gene chip; Pathogen;
微流控芯片技术是通过生物学、化学、医学、电子、材料、机械等多学科交叉, 将分子生物学、化学分析、医学等领域所涉及的样品前处理、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上, 从而实现从样品前处理到后续分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术, 具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点, 已在多个领域得到应用[1,2], 2003年《福布斯》杂志把这项技术评为“影响人类未来15件最重要发明之一”。微流控芯片技术的特点, 一是微流体的层流效应、表面张力及毛细效应、快速热传导效应和扩散效应等一系列特殊效应, 有利于精确流体控制和实现快速反应;二是结构复杂性, 微加工工艺具有加工小尺寸、高密度微结构的能力, 便于实现各种操作单元的灵活组合与规模集成。因此, 样品前处理、分离与分析、检测等实验流程得以在同一芯片上集成化和并行化, 从而达到微型化、自动化、低消耗和高效率的目的[3,4]。生物芯片是微流控芯片的特殊类型, 包括基因芯片 (包括DNA和RNA芯片) 、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等, 是微流量为0的点阵列型杂交芯片。
1 、微流控芯片技术研究
微流控芯片的技术研究涉及芯片分类、加工、封合、微流体驱动、信号收集、分析检测等环节。
1.1、 微流控芯片的分类
根据微流控芯片反应原理的不同可分为:白金电阻芯片、压力传感芯片、电化学传感芯片、纳米反应器芯片、微流燃料芯片等。根据微流体芯片的结构差异, 可将PCR芯片分成静止与动态PCR芯片;也可分为微池型PCR、蛇形通道PCR、螺旋通道PCR、振荡式PCR及闭环式PCR等。静态PCR的特点在于体系不流动, 通过芯片整体升温、降温的循环来实现反应;动态PCR则由液体通过不同温区进行扩增。
1.2、 微流控芯片的制作
微流控芯片的制作包括芯片加工、封合等环节, 主要依托于MEMS (MicroElectro-Mechanical System) 加工工艺, 具有在微米级实现微量流体操控的能力。用于微流控PCR芯片的材料有硅、玻璃、石英、金属有机聚合物和特殊材质的纸等, 其中, 玻璃的机械强度较高是制作PCR芯片的主要材料;高分子聚合材料聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 和环状烯烃共聚高分子 (COC) 因其生物相容性好, 可塑性强、亲和力强, 成本低、制作过程简单, 多用于制作生化分析器件[5]。微流体通道的加工工艺有软光刻和刻蚀技术、热压法、模塑法、注塑法LIGA法 (集合光刻、电铸和塑铸) 和激光烧灼法等传统方法以及3D打印等新手段[6];微流体通道的封合可采用等离子表面处理或深紫外照射后即时贴合、超声焊接、激光焊接、贴膜法等, 主要考虑老化及管道堵塞等问题。
1.3、 微流控芯片的检测分析
微流控芯片的驱动方法主要有电驱动、磁场法、离心力、光控法、泵推法等。由于芯片的结构复杂, 液体驱动主要依靠外置泵和阀配合使用, 易产生通道“死体积”, 引起交叉污染。因此, 对微液滴操控方法的研究成为这一领域的研究重点[7]。微流控芯片的分析主要是对液滴信号进行采集, 包括电信号的导出、扩增曲线的采集和可视化读出。
根据微流控芯片的功能不同, 其所需要的检测及分析方法也不同。如在线荧光扩增曲线检测法包括终点检测、实时检测、荧光融解曲线分析, 提高了检测通量, 减少交叉污染的风险。微池型PCR芯片与荧光检测相结合, 进行数字PCR检测[8]。另外, 根据不同的检测目的, 还可采用电化学方法、DNA杂交微阵列法、质谱等在线检测方法。因微电极可以加工到芯片上, 因此电化学检测法更适合于微流控芯片的检测;质谱法最大的优点是能提供分子空间结构信息, 因此在生物大分子 (如蛋白质) 的结构研究方面具有独到之处, 但因为质谱检测系统本身比芯片还要大, 所以很难实现整个系统的微型化。
2 、微流控芯片的应用
微流控芯片从方法研究、平台构建到应用拓展, 已成为多专业交叉的强大科研技术平台, 在生命科学领域, 蛋白质组学、杂交测序、代谢物分析、转基因产品检测、体外临床诊断、病原体检测等方面都有广泛的应用及巨大的应用前景[9]。
微流控芯片可进行DNA单分子扩增及核酸定量, 实现全自动PCR分子诊断[10,11];微流控芯片与质谱相结合, 可用于大规模、高通量的蛋白分析和鉴定, 在蛋白质组学研究中具有很大优势。
2.1、 在生物化学分析中的应用
微流控芯片在细胞的培养、分离、组分分析及细胞操纵方面都有应用。单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗、药物筛选及细胞生理、病理过程的研究有重要意义。将光镊或超声捕获、光穿孔、细胞裂解、电泳分离和细胞流失计数等操作单元集成到一块微流控芯片上, 并把得到的信息汇总分析, 可以完成对单个细胞的精准操控[12,13]。北京大学和浙江大学报道了一种针对尿液脱落肿瘤细胞 (UETCs) 的微流控检测技术, 利用单克隆抗体CK20、CD44v6进行膀胱癌的准确诊断[14];还有一种基于微流控芯片的单细胞检测EGFR多突变的方法, 通过捕获和免疫荧光成像单个EGFR表达细胞, 发现特定的EGFR多突变和其他单细胞信息, 用于癌症靶向治疗前的常规检测[15]。
微流控PCR芯片与传统的PCR比, 传热速率快, 内部温度均匀, 反应过程易于控制, 而且反应所需的样品和试剂量少, 大大降低成本。如振荡型巢式PCR芯片可在55 min内完成对酪氨酸激酶基因的扩增, 用于恶性黑色素瘤的诊断;微池型微流控PCR芯片对假体关节液中的细菌进行检测和分型, 指导合理应用抗生素[8]。目前, 微流控PCR芯片在病毒检测、传染性疾病、食品和水质检测、致病菌鉴定及微生物重要基因检测、农作物病菌、畜禽病毒的检测及农作物基因研究方面都有广泛应用[16,17,18]。
2.2、 在体外诊断中的应用
微流控芯片是临床体外诊断的有利技术平台, 因其体积小巧、操作简单, 极大地拓展了体外诊断的应用空间[19], 提高了分析效率, 在全血和体液中血糖的测定、雌激素提纯、氨基酸代谢失调生物标记物检测中应用较多[20]。在即时诊断 (POCT) 领域, 微流控芯片技术在临床分析 (血气分析、葡萄糖/乳酸分析等) 、DNA分析、蛋白质组学分析 (蛋白质和肽) 、免疫测定、毒性检测和法医鉴定等领域具有广阔的应用前景[21,22]。目前, 已有多家公司推出了微流控POCT产品, 包括血糖仪、血液分析仪等, 可支持血气、电解质、生化、血凝、心肌标志物等物质的快速检测, 以及难以培养、鉴定的病原微生物 (如结核杆菌、病毒、支原体等) 的现场快速检测等[23]。
2.3、 在病原微生物检测中的应用
利用微流控芯片可同时检测多种病原菌和病毒[24,25]。基于微流控芯片的蛋白质免疫分析方法, 利用电渗流分离和紫外分光光谱检测等技术, 使待测样本在设定好检测程序的芯片上自动完成检测, 整体反应效率大大提高[26];通过生物发光信号与适配体之间的相互作用, 检测时间可缩短至10 min以内, 对于临床快速检验有较广阔的应用前景[27]。广州医科大学开发了液滴阵列微流控芯片核酸分析系统、微流控芯片免疫化学发光分析系统, 包含机械、磁力和光学检测单元, 设计紧凑, 可程序化完成细胞裂解、核酸结合、磁珠洗涤、核酸洗脱、扩增、检测等一系列步骤, 可用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、生殖道支原体等4种性传播疾病病原体的筛查[28]。
2.4、 在药物筛选中的作用
传统的药物筛选和新药研发需要分析大量候选药物的活性成分、作用靶点、代谢以及毒性等, 而微流控芯片因其高通量、自动化、快速的特点可用于药物的筛选[29,30,31]。目前已将微流控芯片与质谱联用, 整合细胞培养、代谢物产生、样品预处理和检测等多个单元进行药物代谢研究, 集成化的微流控芯片也可同时进行高通量细胞毒性筛选和代谢物的在线监测[32]。
体外抗肿瘤药物敏感性可指导抗肿瘤药物的临床使用, 细胞水平的药物测试是判定抗肿瘤药物敏感性的有效手段之一。微流控肿瘤微阵列药物测试系统集成了细胞培养阵列、自动细胞培养、换液、多药物处理以及细胞存活检测等功能[33], 依据细胞存活率筛选出最佳的抗肿瘤药物组合。
2.5、 在仿生研究中的应用
器官芯片 (Organs-onchips) 是一种利用微加工技术, 在微流控芯片上制造出能够模拟人类器官主要功能的仿生系统。通过特定方式将细胞培养系统组装到微流控芯片中, 根据生物体中的器官结构在体外对其进行重建, 构建细胞图形化培养, 从而模拟人体器官的复杂结构、微环境和生理学功能, 用以研究特定环境下器官的生理机能和构建体外疾病模型。这种技术对于药物毒性和药效的预测比常规体外模型更有潜力, 应用于药物的吸收、分布、代谢和排泄的预测以及药物毒性的研究。
中科院大连化学物理研究所先后在微流控芯片上完成一系列的细胞培养、兔软骨组织培养, 以及带有肝微粒体的药物代谢等研究, 并提出微流控芯片仿生组织-器官的概念[34]。针对人工辅助生殖技术存在受精成功率低和胎儿出生后风险高的问题, 有人研发了微流控芯片子宫[35], 通过细致模拟子宫环境, 完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等生理过程, 提高了胚胎形成率。
3、 结语
毫无疑问, 微流控芯片技术具有高通量、低消耗、便携化、集成化和大规模平行处理等很多优势, 操作简便, 节约试剂和样本。但也有很多亟待解决的问题, 如样品制备复杂、加样难度大、结果的可重复性较差, 芯片的特异性、灵敏度、集成能力等方面还需提高。
当前, 微流控芯片的研究、应用及产业化都在快速发展, 主要增长点是医药研究和即时诊断。但是现实中的微流控技术产业进程仍然是步履艰难, 从技术角度来看, 微流控产品开发涉及多个学科领域, 包括生物、化学、工程、医学及信息学等。作为微流控系统的核心, 微流控芯片的设计、材料选择、表面处理、芯片加工乃至包装保存, 都具有一定技术难度。总之, 微流控芯片作为多学科发展的重要技术平台, 正处于非常重要的发展阶段, 已引起学术界和产业界的重视。
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