放线菌是一群革兰阳性、G+C%含量高达55%的细菌，属原核生物类群，在自然界中分布很广，因其菌落呈放线状而得名。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是由各种放线菌产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂，如细胞色素P450酶(CYP)。CYP是一类血红素结合蛋白，可修饰各种天然化合物，包括多酮类化合物、脂肪酸类固醇和一些芳香族化合物。
环孢菌素具有高效免疫抑制作用，抗HIV-1病毒和逆转肿瘤多药耐药性等作用。但是，环孢菌素的肝肾毒性以及生物利用度低等缺点影响了它在这些领域的开发利用。因此，对环孢菌素的免疫抑制作用机制等生物活性进行研究，并在此基础上寻找作用特异、毒副作用低、生物利用度高、活性更强的低毒高效衍生物已成为世界范围内研究开发环孢菌素的一个热点。有研究表明稀有放线菌Nonomuraea dietziae具有重要的工业意义，它编码表达的CYP蛋白区域选择性羟基化环孢菌素A，得到四羟基环孢菌素衍生物[γ-HyMeLeu4]CyA，为了更好的开展[γ-HyMeLeu4]CyA工业化生产，提高收益，降低生产成本，本研究对该菌株发酵配方和培养条件进行优化，最终使[γ-HyMeLeu4]CyA摇瓶效价提高了63%左右。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
稀有放线菌Nonomuraea dietziae ZL-10-3由本实验室保存。
1.1.2 培养基
(1)分离及斜面培养基(%) 酵母粉0.4，麦芽粉1.0，葡萄糖0.4，琼脂2.0，pH7.0。
(2)种子培养基(%) 淀粉1.0，葡萄糖0.7，麦芽粉0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.5，碳酸钙0.7，pH7.0。
(3)发酵培养基同种子培养基。
1.2 方法
1.2.1 斜面培养
用竹签挑选单个菌落转接于斜面培养基，28℃下培养15d。
1.2.2 摇瓶培养
斜面上的孢子接种于种子培养基中，28℃，220r/min培养44~48h，然后以10%的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220r/min摇床培养，24h后向发酵培养基中添加底物环孢菌素A，添加量为300μg/mL，添加底物后的培养时间为120h。
1.2.3 发酵条件优化
在40mL的三角瓶发酵体系(总容积250mL)中，按1.2.2的发酵条件，分别对底物添加时间，添加量和添加底物后的培养时间进行优化研究。
1.2.4 样品检测
4mL发酵液倒入刻度离心管中，加入1mL无水乙醇，3000r/min离心10min后取上清液，HPLC 法测发酵效价(μg/mL)。
2 结果和分析
2.1 配方优化
本实验室初始的发酵培养基和种子培养基共用一种配方，为了提高目标产物收益，依照生产上的经验，我们对糊精、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和黄豆饼粉这5个因素的配比进行了考察。设糊精、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和黄豆饼粉五个因素分别为自变量X1、X2、X3、X4和X5，相对发酵效价为因变量Y1，各因素及水平列表1。根据均匀设计V4.0 版软件提供的模型，设计实验。
由该模型得到的最优发酵培养基组成为：糊精1.2%、葡萄糖3.0%、酵母粉0.9%、蛋白胨0.5%、黄豆饼粉1.5%，预测最优结果为147.4μg/mL。经3批验证实验，相对效价依次为135.1%，140.6%和136.8%，平均效价为137.5%，结果表明该配方所得发酵效价相比对照平均提高约37.5%，优于设计实验中各组配方。
2.2 培养条件优化
2.2.1 底物添加时间对发酵单位的影响
底物添加时间对发酵单位的影响非常大，过早菌体生长不成熟，过晚菌体老化，酶活降低。我们分别选取0、12、24、36和48h共计5个时间点向发酵培养基中添加底物环孢菌素A。由图1可知，48h时该菌发酵单位较36h时的高，但是幅度不大，为了缩短发酵周期，减少生产成本，我们选择36h为最适的底物添加时间。【图1】
2.2.2 底物添加量对发酵单位的影响
因为底物环孢菌素A是溶解在有机溶剂甲醇中，甲醇和环孢菌素A本身对菌体有影响，浓度过高会抑制菌体生长，从而造成转化收益降低。按照1.2.2摇瓶发酵培养条件，分别选取200、300、400、500和600μg/mL这5种底物浓度，考察何种浓度是添加底物的最适浓度。根据图2显示，终浓度为400μg/mL即1mL发酵培养基中含400μg的环孢菌素A底物时，衍生物有最大的收益。【图2】
2.2.3 培养时间对发酵单位的影响
按照1.2.2摇瓶发酵培养条件，分别选取添加底物添加后的24、48、72、96、120和144h共计6个时间点放瓶。由图3可知，添加底物96h后发酵单位达到最高，之后无明显变化。于是我们选择96h为最适放瓶时间。【图3】
2.3 验证试验
本研究在优化后的发酵培养基和培养条件下对菌株ZL-10-3进行试验验证，结果表明，[γ-HyMeLeu4]CyA的产量从174.2μg/mL提高到了284.3μg/mL，较优化前提高了63%左右。
3 结论
本研究利用稀有放线菌Nonomuraea dietziae编码表达的CYP蛋白酶一步合成 [γ-HyMeLeu4]CyA[13]，较之化学合成，生物体内转化合成产物单一，便于生产上的分离提取，对环境污染小更加适应目前环境保护的要求。
关于稀有放线菌Nonomuraea dietziae更多的是在基因功能的报道，本研究首次从工业方面着手，采用均匀设计法对[γ-HyMeLeu4]CyA转化菌Nonomuraea dietziae的发酵培养基配方进行优化，并对其培养条件进行摸索，最终获得了最佳的发酵培养基和最合适的培养条件。后续研究可在菌种选育方面进一步优化，以便适应工业化的大规模生产。
