摘要：截短侧耳素类是具有较好抗菌活性的抗生素,是截短侧耳素类半合成衍生物的前体。主要用于防治敏感菌的感染和促进畜禽生长，本文旨在制订截短侧耳素发酵液的检验规程，规范截短侧耳素发酵液的质量检验。方法采用高效液相色谱法（HPLC法）测定截短侧耳素发酵液含量。通过精密度实验、重复性试验，测定截短侧耳素发酵液含量，相对标准偏差（RSD）测定结果令人满意。本方法简便、快捷、准确，可作为截短侧耳素发酵液的质量标准，用于截短侧耳素发酵液的含量测定，以控制、保证产品质量。
关键词：截短侧耳素发酵液; 精密度; 重复性试验;
Discussion on Determination of the Content of Pleuromutilin Fermentation Broth by HPLC Method
KURIZADA·Murati
Veterinary Drug and Feed Supervision Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region
Abstract：Pleuromutilin is an antibiotic with good antibacterial activity and also is a precursor of semi-synthetic derivative of pleuromutilin. It is mainly used to control the infection of sensitive bacteria and promote the growth of livestock and poultry. In order to formulate the procedure for inspection of pleuromutilin fermentation broth and to standardize its quality inspection. The high performance liquid chromatography method(HPLC) was adopted to determine the content of pleuromutilin fermentation broth. By precision test and repeatability test, the broth content was measured, and the relative standard deviation(RSD) was satisfactory. This method was simple, rapid and accurate, and it could be used as the quality standard for determination of content of pleuromutilin fermentation broth to control and ensure product quality.
兽药在保证动物源性食品供应方面发挥着巨大作用。随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性问题变得日益严重，多药耐药菌感染已成为威胁人类健康的重要问题，截短侧耳素类是具有较好抗菌活性的抗生素家族，对大部分革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果。截短侧耳素发酵液具有毒性较低，对环境影响小等特点。
1 材料与方法
1.1 仪器
高效液相色谱仪：Agilent1260(美国Agilent公司)；十万分之一天平（Mettler xs105);5 mL一次性注射器。
1.2 试剂和试药
甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司），乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司），水（超纯水），高氯酸（分析纯，北京北化精细化学品有限公司），碳酸铵（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；截短侧耳素标准品(批号为20170314，含量为99.7%,中国兽医药品监察所)，截短侧耳素发酵液（发酵放罐样品）。
1.3 溶液的制备
1.3.1 高氯酸溶液（6%)
量取400 mL超纯水置于500 mL容量瓶中，再用刻度吸管移取41.7 mL高氯酸（分析纯）置于该容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀。
1.3.2 碳酸铵缓冲溶液（1%)
精确称量10 g碳酸铵（分析纯）置于1 000 mL容量瓶中，加入800 mL超纯水溶解，用刻度吸管移取6%高氯酸溶液24 mL加入其中，再用超纯水稀释至刻度混匀，过滤，待用。
1.3.3 流动相溶液
按照碳酸铵缓冲溶液（1%）：色谱级乙腈：色谱级甲醇28:23:49的比例混合均匀，再用0.45μm的过滤膜过滤，滤液置于所配体积的容量瓶中，超声15 min脱气，备用。
1.4 标准品溶液
精确称量截短侧耳素工作标准品适量（约0.1 g）（精确至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，用流动相溶解，超声15 min，使之充分溶解，冷却，定容，配成浓度为2 mg/mL的溶液，待用。
1.5 样品溶液的制备
根据发酵周期，预估含量称重，放入50 mL容量瓶中，加入流动相30 mL左右溶解，振荡超声15min，冷却至室温，用流动相定容至50 mL，用微孔滤膜过滤器过滤。
式中：m1—标准品重量（g);a—标准品含量（μg）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为C18,4.6 mm×250 mm,5μm,流动相为碳酸铵缓冲溶液（1%）：色谱级乙腈：色谱级甲醇2823:49的比例混合均匀，再用0.45μm的过滤膜过滤，滤液置于所配体积的容量瓶中，超声15 min脱气，备用，流速为1.2 mL/min，检测波长为212 nm，柱温为30±3℃，进样量20μL。
2.2 检测方法
首先进标准品溶液两针（1.4），记录相关峰面积，再进样品溶液两针（1.5），记录相关峰面积，计算截短侧耳素发酵液含量（发酵350 h以上的效价，应≥10 000μg/g）。计算公式为
式中：S1—待测溶液色谱图峰面积；S0—标准品溶液色谱图峰面积；m0—标准品重量（g);m1—待测溶液重量（g);A—标准品的含量（%）。(结果见图1、图2)
图1 截短侧耳素标准品色谱图
图2 截短侧耳素发酵液样品色谱图
2.3 检测结果
含量测定结果，见表1。
表1 含量测定结果表
2.4 精密度试验
取1.5项下截短侧耳素样品20μL，按2.1项下色谱条件重复进6次，记录色谱图峰面积，结果见表2，截短侧耳素峰面积的RSD为0.13%，表明色谱系统精密度良好。
表2 精密度试验表
2.5 重复性试验
取按1.5项制备的6份供试品，按2.1色谱条件分析，记录色谱图，计算含量，平均值为17 973.7μg/mL,RSD为0.1%，表明该方法中截短侧耳素的重复性良好，结果见表3。
表3 重复性试验表
3 讨论
用该方法测定截短侧耳素发酵液含量，同一样品平行测定6次，平均含量值为17976.6μg/g，峰面积的RSD为0.13%；经测定6个样品含量平均值为17 973.7μg/g;RSD为0.10%；截短侧耳素发酵液经过精密度试验、重复性试验测定结果RSD均在规定的范围内，灵敏度高，前处理简便，样品较稳定，符合规定。
用HPLC法测定截短侧耳素发酵液含量，适用范围广，方法合理、操作便捷，大大缩短检验时间。适合于截短侧耳素发酵液的检测，并控制该产品的质量，可作为截短侧耳素发酵液的质量标准，用于截短侧耳素的含量测定，以控制、保证产品质量。
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