摘要：通过在黄姜发酵过程中添加氯化钙,探究Ca2+作为激活剂对黄姜皂素得率的影响。以黄姜皂素得率为考察指标,在单因素试验的基础上,利用正交试验对黄姜发酵条件进行优化。结果表明,最适发酵条件为：CaCl2添加量0.3%、pH为5.5、发酵温度60℃、发酵时间48h。在此条件下黄姜皂素得率为0.825%,高于自然发酵的得率0.692%。
关键词：钙离子激活; 黄姜; 皂素得率; 发酵;
Study on Fermentation Conditions in the Production of Turmeric Saponin
JIANG Yuanyuan WU Zhengqi ZHOU Mingzhe WAN Duanji
School of Civil Engin.,Architecture and Environment,Hubei Univ.of Tech. School of Biological Engin.and Food Sci.,Hubei Univ.of Tech.
Abstract：The effect of Ca2+ on the yield of turmeric saponin was investigated by adding calcium chloride during the turmeric fermentation.Based on the single factor experiments,the fermentation conditions for turmeric were optimized according to the orthogonal experimental results.It was indicated that the optimal conditions for turmeric fermentation were as follows:CaCl2 addition of 0.3%,pH of 5.5,fermentation temperature of 60°C and fermentation time for 48 h.Under these conditions,the yield of turmeric saponin reached up to 0.825% which was higher than 0.692%at of natural fermentation.
黄姜，学名盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），是薯蓣皂素含量最高的植物[1]。黄姜皂素又称薯蓣皂苷元，是薯蓣属植物薯蓣皂苷的水解产物，其与甾体类激素药物结构药物相似，是合成甾体激素的重要基础原料，被医药界称为“药用黄金”，药用价值高，具有广阔的应用前景[2]。目前，在黄姜皂素工业化生产中普遍采用先发酵后水解的方法，相比直接水解，黄姜皂素提取率有明显提高。一般认为发酵的作用是促进黄姜皂素前体物质转化为黄姜皂素，从而提高黄姜皂素的得率，但对发酵机理并没有统一的理论认识[3,4]。发酵的方式通常有自然发酵、酶解发酵、微生物发酵等[5]，李江浩等[2]发现“发酵”过程与黄姜细胞内源酶活性密切相关，通过添加EDTA作为金属离子螯合剂，能明显抑制黄姜内源酶活性，从而降低黄姜皂素得率。而钙离子一般是酶的激活剂，因此，本实验通过添加氯化钙对黄姜进行预处理，以Ca2+作为酶激活剂，研究在发酵过程中Ca2+对黄姜皂素提取率的影响，并对发酵条件进行优化，从而达到降低生产成本，提高黄姜皂素的提取率的目的。
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
黄姜根茎湖北竹溪县购；黄姜皂素标准品北京世纪奥科生物技术有限公司；浓硫酸（98%）、石油醚（30℃～60℃）、氯化钙等均为分析纯试剂。
1.2 主要仪器与设备
戴安UltiMateTM300高效液相色谱、打浆机、ZXFD-B5040恒温鼓风干燥箱、索氏提取器、电子分析天平、TDL-5-A离心机、SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器、ST2100pH计、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器。
1.3 实验方法
1.3.1 黄姜皂素提取流程
鲜黄姜→打浆→发酵→过滤、水洗→滤渣酸水解→中和、过滤、水洗、烘干→石油醚索氏提取→浓缩、结晶、脱色→黄姜皂素。
1.3.2发酵方式的选择
称取一定量的鲜黄姜，在发酵温度为60℃、时间为48h、pH为5.5条件下，分别进行自然发酵和添加0.5%氯化钙发酵，按照1.3.1的工艺流程进行提取，考察不同发酵方式对黄姜皂素得率的影响。
1.3.3 发酵条件优化的单因素实验
取一定量的鲜黄姜，打浆。在发酵时间为48h、pH为5.0、氯化钙添加量为0.5%的条件下，分别调节发酵温度为45、50、55、60、65和70℃，研究不同发酵温度对黄姜皂素得率的影响。在最佳发酵温度下，控制pH为5.0，氯化钙添加量为0.5%，分别发酵12、24、36、48、60和72h，分析不同发酵时间对黄姜皂素得率影响。在最佳发酵温度和最佳发酵时间下，添加0.5%氯化钙，分别调节发酵液pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，研究pH对黄姜皂素得率影响。在最佳发酵温度、最佳发酵时间和最佳pH值条件下，向发酵液中分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%氯化钙，以黄姜皂素得率为指标，分析氯化钙添加量对黄姜皂素得率的影响。所有实验组别均按照1.3.1所述工艺流程进行。
1.3.4 发酵条件优化的的正交试验
在以上单因素试验的基础上，以发酵时间、发酵温度、发酵pH和氯化钙添加量为正交试验的因素，以黄姜皂素得率为指标，设计4因素3水平正交试验，优化黄姜皂素生产工艺的的发酵条件，筛选出最佳发酵条件组合。因数水平表如表1所示。
表1 因素水平表
A为发酵温度，℃；B为发酵时间，h;C为pH值；D为CaCl2添加量，%
1.4 检测与分析方法
1.4.1 黄姜皂素含量测定
精密称取12.5mg黄姜皂素标准品，采用甲醇并配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，用0.45μm有机滤膜过滤，制备标准溶液。将标准溶液分别稀释成浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mg/mL溶液，备用。参考肖婉娜等[6]建立的黄姜皂素高效液相色谱检测条件：色谱柱：Waters 5C18-MS-Ⅱ色谱柱（4.6×250mm）；流动相：乙腈-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样量：20μL，进行检测并绘制标准曲线。黄姜皂素标准曲线线性方程为y=273.23x-4.6482(R2=0.9974），表明该方法在0.05～0.4mg/mL线性良好。
1.4.2 黄姜皂素得率计算
采用甲醇对得到的黄姜皂素进行溶解，按照1.4.1建立的检测条件进行检测。按下式计算黄姜皂素的得率。
式中：C为进样液中黄姜皂素浓度，mg/mL;n为稀释倍数；V为溶解液体积，mL;m为黄姜的质量，g。
2 结果与分析
2.1 不同发酵方式对黄姜皂素得率的影响
由表2可以看出，在发酵过程中添加氯化钙，黄姜皂素的得率显著高于自然发酵后黄姜皂素的得率。由于金属离子可以改变发酵途径中关键酶的活性，从而改变发酵产物的量[7]。部分金属离子对酶有激活作用，Ca2+是大多酶促反应的激活剂[8]，因此，添加Ca2+可以促进黄姜自身中以金属离子为辅基的生物酶的活性，提高黄姜皂素得率。
表2 不同发酵方式黄姜皂素得率
2.2 发酵条件单因素试验
2.2.1 发酵温度对黄姜皂素得率的影响
由图1可知，随着发酵温度的提高，黄姜皂素的得率呈现先上升后下降的趋势。这可能是由于，在45～60℃范围内，随着温度的升高，钙离子提高了黄姜皂素内源酶的活性[9]，促进了黄姜皂素前体物质转化为黄姜皂素；当温度达到60℃时，得率达到最高值为0.83%，而当温度继续升高，黄姜皂素内源酶变性失活，从而得率降低。
图1 发酵温度对黄姜皂素得率的影响
2.2.2 发酵时间对黄姜皂素得率的影响
由图2可知，黄姜皂素得率随发酵时间的增大而增大，最后趋于稳定。所以，比较适宜的发酵时间为48h。若发酵时间再延长，则发酵液中微生物增多，会使发酵液产生臭味，不利于实验的进行。
图2 黄姜皂素得率随发酵时间延长的变化
2.2.3 发酵的pH对黄姜皂素得率的影响
由图3可知，随着发酵液pH的增大，黄姜皂素得率呈先上升后下降的趋势。当pH从4.0增大至5.5时，得率不断增大；当pH为5.0时达到最大值为0.82%；当pH继续增大至7.0时，得率逐渐降低，这可能是由于过高的pH，不利于黄姜皂素内源酶的结构稳定，易导致其变性，降低了黄姜皂素前体物质转化为黄姜皂素的能力。所以，pH为5.5左右是黄姜皂素内源酶适宜的pH。
图3 pH值对黄姜皂素得率的影响
2.2.4 CaCl2添加量对黄姜皂素得率的影响
由图4可知，在发酵过程中随着CaCl2添加量的增多，黄姜皂素得率逐渐增加，当添加量达到0.3%后，得率基本保持稳定。CaCl2添加量在0.3%时，黄姜内源酶活性最强，同时Ca2+对纤维素酶、蛋白酶、植酸酶等具有一定的促进作用[8]，在发酵过程中促进淀粉、纤维素的降解从而释放出被包裹的黄姜皂苷，增大黄姜皂素得率，降低生产成本。
图4 CaCl2添加量对黄姜皂素得率的影响
2.3 发酵条件的正交试验
根据表1设计的因素进行L9(34）正交试验，对黄姜皂素发酵条件进行优化，正交试验的结果如表3所示。
表3 正交试验结果
由表3可知，CaCl2添加量对黄姜皂素得率的影响最为显著，说明钙离子对内源酶具有明显的激活作用。其他因素对黄姜皂素得率的影响的主次顺序为pH、发酵温度、发酵时间，最优的发酵组合为A2B2C2D2，即CaCl2添加量0.3%、pH为5.5、发酵温度60℃、发酵时间48h。在此条件下，黄姜皂素的得率最高。由于最优条件未出现在正交试验表中，因此对该条件进行三组平行验证实验，黄姜皂素得率为0.825%。
3 结论
1）发酵过程中添加Ca2+可影响黄姜皂素的得率，将其与自然发酵的方式对比，发现，添加Ca2+发酵可以促进黄姜皂素得率的增加。
2）在黄姜发酵过程中添加氯化钙的最适发酵条件为：CaCl2添加量0.3%、pH为5.5、发酵温度60℃、发酵时间48h。各因素对得率的影响大小顺序为：CaCl2添加量>pH>发酵温度>发酵时间。
参考文献
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