1 肌球蛋白的结构与功能
肌球蛋白主要存在于平滑肌中， 它是肌原纤维粗丝的组成单位。 其分子形状如豆芽状，由多条重链与多条轻链组成。 肌球蛋白的家族较大，目前发现的肌球蛋白有 24 种，但依据其来源又可分为传统的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白，如传统的肌球蛋白为肌肉的肌球蛋白，即肌球蛋白Ⅱ，但非肌肉细胞也存在肌球蛋白Ⅱ， 为非肌肉肌球蛋白Ⅱ； 非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，只存在于非肌肉细胞中；肌球蛋白Ⅷ、Ⅺ和Ⅻ只存在于植物当中。此外，肌球蛋白Ⅰ在生物体内的作用是细胞运动，胞引作用和泡液收缩；骨骼肌肌球蛋白Ⅱ的作用是使骨骼肌肌肉收缩； 肌球蛋白Ⅴ主要功能是靶向小包运输和 mRNA 的靶向运输[1].
在生物有机界中，利用化学能/化学势能进行机械做功的生物大分子，称为分子马达。 而肌球蛋白作为一种分子马达[2],参与了肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等活动[1].
目前研究得较多的是肌球蛋白Ⅱ， 其最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中， 形状如“ Y”型，是一个六聚体的大分子蛋白质，包括两条相对分子质量约为 220 kD 的重链、两条约 17 kD的必须轻链和两条约 20 kD 的调节性轻链[3]
. 根据重链在细胞内所起的作用， 按照结构和功能不同可划分为 3 个区域：1）位于重链的 N 末端形成一个球状的头部，含有一个肌动蛋白（ actin） 结合位点和 ATP 结合位点的催化区域，负责释放化学能；2）重链的 C 末端则形成一个细长的 α-螺旋状的尾部， 尾部结构域含有决定尾部是同膜结合还是同其他的尾部结合的位点；3）连接头尾的是 α-螺旋状的颈部，其与必须轻链、调钙素或类似钙调素的调节轻链相连， 颈部是起到水平臂作用的区域， 在这个区域中通过 ATP 水解将产生动力冲程，实现将化学能转化为机械能[4].
通过对各个物种的肌球蛋白重链， 轻链序列的功能结构域分别进行氨基酸水平上的多序列比对，结果发现肌球蛋白较为保守，只是个别氨基酸序列存在差异， 这表明各个物种肌球蛋白磷酸化的作用机制与功能大体一致（ 图 1）。
2 肌球蛋白轻链的磷酸化由肌动蛋白-肌球蛋白（actin-myosin）相互作用介导的细胞收缩，对肌肉与非肌肉细胞的一些生理活动起着至关重要的作用，包括细胞分裂、粘连、趋化性和胞质分裂[5],其动力学活性会调控细胞收缩，调节血管渗透性，控制平滑肌细胞中的血压[6].
2.1 肌球蛋白轻链磷酸化的作用机制。
肌球蛋白（ 平滑肌与非肌肉蛋白）受肌球蛋白轻链（ MLC）磷酸化调控[7].磷酸化的肌球蛋白是维持细胞骨架活性及细胞功能的重要效应因子[8, 9].
肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, ML-CK） 和 ROCK/ROK/Rho 激 酶 （Rho kinase, ROCK）是在体内和体外使 MLC 磷酸化的两种重要激酶[10].
通常认为， 当 Ca2+与钙调蛋白复合体（Calmodulincomplexes,CaM）结合后，会激活 MLCK,进而 ML-CK 使 肌 球 蛋 白 轻 链 20 （myosin light chain 20,MLC20）上第 19 位的丝氨酸（ Ser19）磷酸化，导致激活肌球蛋白头部的 Mg2+-ATP 酶（简称 ATP 酶）[11],该酶水解 ATP 产生能量会使其构象发生转变，这种构象会使肌球蛋白去结合肌动蛋白（ actin），利用ATP 形成一种细胞收缩的压力[12]. 相反地，用肌球蛋白轻链磷酸酶（ （myosin light chain phosphatase,MLCP） 使 MLC 去磷酸化后会使构象弯曲，结合肌动蛋白的能力下降。 MLCP 是一个异源三聚体蛋白，由磷酸酶（ PP1C）、肌动蛋白结合区和调节区域（ MYPT） 以及一个 20 kD 的小亚基（ ML20） 组成，但 ML20 的功能尚不清楚。MLC 的这种周期性的磷酸化与去磷酸化的状态， 是细胞发生运动和收缩的必备条件[13].
RhoA 的 效应分子 ROCK[14]是肌球蛋白磷酸化和调节肌球蛋白功能的另一个重要调节因子，它使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶（ MLCP）的位点（MBS）磷酸化[15],抑 制 MLCP 活 性 ,从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平， 诱导 RhoA 介导的应力纤维和粘着斑装配。在平滑肌和非肌细胞中，ROCK还能直接磷酸化 MLC 刺激肌球蛋白收缩[16].
对于所有的肌球蛋白， 大体机制都可以解释为当肌动蛋白结合到马达区域时， 马达运动由于在活性位点 ATP 诱导的构象发生变化引起 RD（ 一种调控区域可以使必须轻链、调节轻链以及重链结合）旋转[17]. RD 包含着重链（ heavy chain,HC）的一段较长的螺旋， 可以使调节轻链（ regualatelight chain,RLC） 和 必须轻链（ essential light chain,ELC） 以反向平行的方式结合。 轻链可以稳定 HC螺旋，然后作为一个较为自由的转换器，由一种构象转换为另一种构象去产生工作的动力。
2.2 肌球蛋白轻链磷酸化的主要生物学功能
2.2.1 磷酸化对细胞迁移的调节
Totsukawa 等在 2004 年将成纤维细胞作为研究材料发现，MLCK 与 ROCK 在调节 MLC 磷酸化时，在 MLC 所处的不同空间分布中起着不同的作用。 在细胞迁移中 MLCK 诱导细胞周边和前端肌球蛋白轻链磷酸化，ROCK 诱导细胞中心肌球蛋白轻链磷酸化。 肌球蛋白Ⅱ在细胞周边的磷酸化有两种功能：第一，阻止由肌动蛋白多聚化产生的突触，以便于细胞迁移；第二，位于细胞周边的肌球蛋白Ⅱ磷酸化对在运动细胞的前端装配成熟的粘附结构是必需的[16].
2.2.2 磷酸化对细胞收缩行为的影响
肌球蛋白Ⅱ产生的收缩力不仅为细胞的迁移提供动力，在维持细胞形态，促进伤口愈合，介导胞外基质和细胞信号转导中也起着重要的作用[16].Beningo 等使用特异性抑制剂 blebbistain 处理后，发现抑制了肌球蛋白Ⅱ的收缩活动， 同时抑制ROCK 也会很大程度减少肌球蛋白Ⅱ的收缩[18].
2.2.3 磷酸化对细胞形态与凋亡的影响
肌球蛋白Ⅱ的活性对于应力纤维粘着斑的形成是必需的。 ROCK 使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶（ MLCP）的位点（MBS）磷酸化，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平，诱导 RhoA 介导的应力纤维和粘着斑装配。 而且它还与整合素介导的一些信号通路相关[16]（ 表 1） .p114RhoGEF 是一种 RhoA 激活剂，能结合到肌球蛋白 IIA 上，并起到一定的调控作用[19, 20],有数据显示，p114RhoGEF 能驱动上皮细胞的迁移，变形虫的运动以及肿瘤细胞的入侵[21].
2.3 肌球蛋白轻链磷酸化的最新研究成果
2.3.1 β-抑制蛋白调控的磷酸化
2013 年 Elie Simard 等通过利用兔子的骨骼肌，发现 β-抑制蛋白可以调控由血管紧张肽Ⅱ型1a 受体（AT1aR）刺激的肌球蛋白 MLC 的磷酸化。β-抑制蛋白属于抑制蛋白家族， 包括 β-抑 制蛋白-1 和 β-抑制蛋白-2, 它可以在哺乳动物组织中广泛表达[5]. β-抑制蛋白介导 G 蛋白耦联受体和其他一些受体的信号通路的调控， 在细胞的生长、凋亡及免疫功能中都发挥了重要作用，并且与一些疾病的发病密切相关。 一些研究表明，β-抑制蛋白-1 对于激活 RhoA/ROCK 以及迫使形成肌纤 维 是 不 可 缺 失 的 . 一 些 G 蛋 白 偶 联 受 体（ GPCRs），如血管紧张肽Ⅱ型 1a 受体（ AT1aR），参与调控细胞收缩[12].而 AT1aR 的拮抗剂Ⅱ（ AngⅡ）能够很好地防治血管收缩类的疾病[22]. 另外，ElieSimard 等利用酵母双杂交系统研究发现，由于β-抑制蛋白-1 的 163-253 位氨基酸包含 MYPT-1的结合区域，所以 β-抑制蛋白-1 1-418 位氨基酸和 1-253 位氨基酸会与 MYPT-1 的 643-943 位氨基酸相互作用。 当受到 AT1aR 的刺激时，β-抑制蛋白-2 也会与 MYPT-1（ 肌球蛋白调控区域）相结合。 通过 β-抑制蛋白诱导会激活 AT1aR 的信号通路，促进 MLC 的磷酸化，而 β-抑制蛋白-2/MYPT-1 复 合体会阻断到 MLCP 亚 基的入口 ,亲和性降低，所以 β-抑制蛋白-2 会使 MLC 去磷酸化。 周期性的 MLC 磷酸化会加速细胞收缩[23].
此研究表明，β-抑制蛋白对于 MLC 的磷酸化与去磷酸化是不可缺失的，当肌肉细胞中缺失 β-抑制蛋白-1,在应对 AT1aR 的刺激下，MLC 的磷酸化水平会下降。经实验发现，这可能是基于两方面的原因： 其一是 MYPT-1 远离了 MLCP 的复合体；其二是依赖 β-抑制蛋白-1 的 RhoA 因子水平下降[24],随后 ROCK 活性损失 ,MLCP 活性增强 ; 但当肌肉细胞中缺失 β-抑制蛋白-2, 在 AT1aR 的拮抗剂 Agonist 的刺激下， 会使 MLC 磷酸化水平升高。 有趣的是，两种 β-抑制蛋白会相互调控 MLC的磷酸化，缺失 β-抑制蛋白-1 或者 β-抑制蛋白-2 对 细胞收缩和运动都会有相似的效果 . 因此 ,MLC 的 磷酸化对细胞收缩和驱动细胞运动起着关键性作用（ 图 2）。
2.3.2 ELC 与 RLC 相互作用对磷酸化的影响
上文提到，肌球蛋白由重链与轻链组成，而轻链又是由必须轻链（ ELC）与调节轻链（ RLC）构成。对于所有的肌肉组织， 收缩与释放都是由细胞内的 Ca2+含量变化调控的。 在横纹肌中，Ca2+结合到细肌丝的肌钙蛋白的复合体上激活肌动蛋白-肌球蛋白（ actin-myosin）ATP 酶，因而发生肌肉收缩。
相比较而言， 在软体动物与脊椎动物的平滑肌和非肌肉细胞中， 收缩的方式有两种： 其一直接由Ca2+结合到肌球蛋白ⅡELC2上；其二是由 RLC 的N-端区域磷酸化，这种磷酸化由 Ca2+依赖的 ML-CK 调控的。
肌球蛋白调控的结构机制首次以原子级的分辨力揭示，扇贝肌球蛋白Ⅱ的 RD 构造包含着 ELC和 RLC,以及可以结合一部分轻链的 HC[25, 26]. 在扇贝肌球蛋白中，Ca2+会结合到 ELC-N 端结构域Ⅰ中的 EF 臂的上。 2012 年 Shaowei Ni 等通过用鸡的平滑肌 HMM 在 Sf9 细胞中表达后得到 HC、RLC 与 ELC 的全长。 研究发现，必须轻链（ ELC）与调节轻链（ RLC）交界处的修饰会阻断激活平滑肌肌球蛋白依赖的磷酸化。他们表达了 16 个平滑肌水解重酶解肌球蛋白（ SmHMM），两条 MLC 与周围的 HC 的衔接处发生突变。 结果发现：1）RLC被 MLCK 磷酸化；2） 亚基组成是正常的，突变并不会降低 ELC 或者 RLC 结合到 HC 的能力；3）依赖肌动蛋白激活的 ATPase 的动力学以及在体外运动的 机 械 性 能 在 去 磷 酸 化 的 状 态 下 与 WTHMM 相一致；4） 对于磷酸化的水解重酶解肌球蛋白（ HMM），缺失肌动蛋白（ actin）状态下其 ATPase活性会被抑制。 另外，当阻断 RLC 与 ELC 的相互作用时， 磷酸化不再有激活 HMM 捕捉肌动蛋白的能力。 经研究发现，这种现象与 RLC 的 M129Q与 G130C 的突变有关。 M129Q 和 G130C 对于稳定结构，激活捕捉 actin 的能力起着关键作用。 同时研究发现， 与 Asp-131 相互作用的 HC 突变体Q826A,也 可以起稳定 RLC/ELC 的 相互作用（ 图3） . 通过突变 HC、RLC 以及 ELC 去破坏三者之间的相互作用，若不发生磷酸化，所有的突变体都与野生型（ wt）的现象相似，相反，肌球蛋白会运动缓慢，ATPase 活性下降。 分子动力学研究表明，阻断RLC/ELC 的相互作用会导致肌球蛋白弹性增加，很可能会阻碍磷酸化的激活。 因此作者猜想，RLC磷酸化重要的功能就是去维持 RLC 与 ELC 相互作用的完整性。 一旦 RLC/ELC 相互作用阻断，结构破坏，就不会再受到磷酸化的调控的影响[27].
3 肌球蛋白重链的磷酸化
非肌肉肌球蛋白Ⅱ是一个六聚体复合物，由两条重链（ NMHC-Ⅱ）、两条必须轻链、两条调节轻链组成。 在脊椎动物中，NMHC-Ⅱ有 3 种异构体，分别是 NMHC-ⅡA（MYH9）、NMHC-ⅡB（MYH10）以及 NMHC-ⅡC（MYH14）[28],在组织和细胞形态中都会表现出不同的模式[29]. 虽然 NMHC-Ⅱ的异构体会有很高的保守性， 但是一些酶的活性还是有些差异的[30]. 另外，NMHC-Ⅱ在细胞中的定位也不一样[31],也会与不同的蛋白结合[32].
3.1 重链磷酸化的作用机制
在哺乳动物细胞中， 肌球蛋白Ⅱ调节轻链的丝氨酸 19（ Ser-19）的磷酸化普遍地参与了体内装配的调控[33],但是，存在一种证据证明非肌肉肌球蛋白Ⅱ装配的调控是可以通过重链的磷酸化来实现的，特别是蛋白激酶 C（ PKC） 与酪蛋白激酶2（ CK2）对肌球蛋白Ⅱ-A 与Ⅱ-B 有着至关重要的作用，PKC 会使 NMHC-ⅡA 的 Ser1916 磷酸化[34].
通过 PKC 或者 CK2 使重链磷酸化会减少肌球蛋白Ⅱ异构体装配成肌丝[35]. 涉及到磷酸化作用，肌球蛋白Ⅱ-A 装配可以通过结合转移因子 mts1 或者钙结合蛋白 S100A4 来调控[36]. S100A4 会优先地结合到非肌肉肌球蛋白Ⅱ-A[37],然后促进单体的、 未装配的肌球蛋白Ⅱ-A 装配[38]. CK2 使NMHC-ⅡA 的 Ser1943 磷酸化会抑制钙结合蛋白S100A4 结合以及 S100A4 诱导的单纤维的装配，S100A4 介 导的肌球蛋白 Ⅱ-A 肌 纤维的去磷酸化[39]. 因此，重链的磷酸化以及 Ca2+的结合会调控S100A4 与肌球蛋白Ⅱ-A 的相互作用。
3.2 肌球蛋白重链磷酸化的生物学功能及最新研究成果
3.2.1 重链磷酸化对癌细胞迁移的调控
2007 年 Natalya G. Dulyaninova 等研究发现，肌球蛋白Ⅱ-A 重链磷酸化可以调控 MDA-MB-231 癌细胞的迁移。 研究中选取了人类胸腺癌细胞肌球蛋白Ⅱ-A 重链，其磷酸化会依赖表皮生长因子（ epidermal growth factor, EGF）。 EGF 通过刺激 MDA-MB-231 细胞会导致装配与重链磷酸化的瞬时增加。 细胞经过 EGF 刺激，肌球蛋白Ⅱ-A重链会在酪氨酸激酶 2 位点（ S1943）磷酸化，肌球蛋白Ⅱ-A 重链 S1943E 与 S1943D 突变体会迁移到创伤位点。 相比较而言，细胞表达的 S1943A 突变体迁移变慢，充分证明肌球蛋白Ⅱ-A 重链磷酸化会介导癌细胞的迁移[40].
3.2.2 棘 阿米巴原虫肌球蛋白 Ⅱ重 链磷酸化对MgATPase 活性的调控
2012 年 Liu 等 通过研究发现了棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ受肌动蛋白激活的 MgATPase 活性是受肌球蛋白马达区域丝氨酸 639 磷酸化调控的， 至今为止并未发现还有其他的肌球蛋白会受这种方式来调控[41]. 先前推测棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ有 MgATPase 活性， 这种活性可以通过两条重链 C-端非螺旋区域的重复序列中 4 个 Ser残基磷酸化来抑制， 研究者利用重组的 WT 与突变的肌球蛋白重新进行了研究， 得到了相反的结论。 HMM 与亚片段 1 有受肌动蛋白激活的 MgATPase 的活性，通过磷酸化作用活性衰减。 通过质谱分析，鉴定了重链上的 5 种 Ser 可以发生磷酸化，4种 Ser 存在于非螺旋结构中，Ser639 存在于马达区域的环 2 中。 通过将 Ser639A 突变，仍然检测到肌球蛋白有 MgATPase 活性，并不会因 Ser 磷酸化而受到抑制。 相反， 亚片段 1 与全长的肌球蛋白的Ser639D 突变失活，与 Ser 磷酸化无关。
4 小结与展望
肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位， 存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用。用蛋白分解酶处理可以将其分割为头部 （ H-酶解肌球蛋白）和尾部（ L-酶解肌球蛋白）。 肌球蛋白作为其重要功能如肌肉收缩、迁移、胞质分裂、细胞凋亡等机制中主要的调节结构域， 其磷酸化与去磷酸化在功能调控方面起着重要的作用。 研究肌球蛋白轻链与重链的磷酸化，为寻求一些肌肉收缩以及其他疾病如慢性阻塞性肺病、充血性心肌衰竭[42]等方面提供了重要的参考依据。更值得一提的是，近年来随着肿瘤细胞研究越来越热， 进而发现了肌球蛋白磷酸化可以介导癌细胞的迁移， 还有一些调控因子可以促进肿瘤细胞的入侵， 这为以后更好地研究癌细胞的运动提供了佐证。但其调控机制并未见过多的文章对其进行阐述，因此，肿瘤运动与迁移很可能成为未来的一个研究方向。 另外最近几年更多的研究发现，肌球蛋白不仅可以发生磷酸化，其被病毒侵袭或者在激素水平（ 如皮质醇）下，肌球蛋白被自身泛素化的报道也屡见不鲜， 但其一些作用机制与功能尚不清楚，因此，肌球蛋白泛素化有可能会成为未来继磷酸化之后的又一研究热点。
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