膜蛋白是生物膜功能的主要承担者，根据膜蛋白的分布，膜蛋白可以分为三类： 外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白的功能具有多方面性，有些膜蛋白可以作为载体而将物质转运出细胞；有些膜蛋白是激素或者其他化学物质的专一受体；有些膜蛋白作为专一的酶催化专一的化学反应。因此细胞的许多功能是通过细胞膜上膜蛋白结构的改变来实现的，而研究膜蛋白的结构便成为了研究膜蛋白功能的重要手段。
迄今为止电镜三维重构技术解析蛋白质结构技术主要分为两种： 单颗粒三维重构技术 （ singleparticle analysis ）[1],电 子 断 层 三 维 重 构 技 术（ electron tomography,ET）[2],以及基于这两种方法的其他方法[3,4].对于具有全同性或高对称性的蛋白质复合物和病毒，可以在纯化分离后，采用单颗粒三维重构技术获得其三维结构，并可达到 0. 4 nm 或更好的分辨率[5 ~9].但样品重构过程中需要平均大量的分子，因而单颗粒电镜研究方法并不适用于非均一结构的蛋白研究，而且蛋白纯化后脱离了完整的细胞环境，不可避免地会发生蛋白结构的改变[10].电子断层技术作为一种从材料科学到生物学都行之有效的技术[10,11],可以得到微观物体的三维密度分布图。在生物学应用中，电子断层技术旨在接近天然条件下研究具有独特结构的物体的三维形态，可以用来研究不具有全同性的超分子体系和亚细胞体系以及研究膜蛋白在膜上的分布和膜蛋白与膜之间的关系，且电子断层成像技术被认为是用来原位研究膜蛋白结构的唯一方法。但断层成像方法的分辨率却远低于单颗粒方法。因此电镜单颗粒重构和断层成像在结构研究上有很大的互补性，将二者有机的结合起来[12],是目前获得生物体系原位高分辨率三维结构很有潜力的研究方法。
1 成像原理技术简介
电子断层技术已经成为一种在纳米级分辨率下探索细胞结构的新兴的有效方法。可以通过加权背投影方法从 2D 投影图像重构出样品的 3D 图像。通过获取同一物体的多个连续角度下的二维投影图反向重构出它的三维结构。简单之，电子断层技术就是将一个样品沿着一个与电子束垂直轴旋转，每旋转一个角度，采集一个物体相对应方向的二维投影图像，通过计算机对这些 2D 图像进行处理，将不同角度的 2D 投影图像反向重构出样品的 3D 结构的技术。
样品电子断层的一个主要特征是分辨率的各向异性，x 轴和 y 轴的分辨率相对较高，而 z 轴的分辨率较差。另一个特征是 ET 的倾斜角范围为 ± （ 65°~ 70°） ,最基本的原因是样品在高倾斜角时，样品的厚度迅速增加，远远超过电子穿透能力。因此会出现高角度投影缺失的现象，这个现象被称为“失踪楔”.由于失踪楔的存在导致 z 轴的分辨率降低。
为了减少失踪楔的影响，数据采集时可以采用双轴倾斜法[13,14],第二个倾斜轴垂直于第一个倾斜轴。尽管各向异性不能完全消除，但使信息丢失区域由“失踪楔”减小到“失踪角锥”,提高了重构后结构的总体质量。
单颗粒方法是对分离的，非有序排列的，具有结构均一性的蛋白颗粒进行解析。其所用的原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影电子显微图像在空间中进行调整后进行叠加平均，从而提高信噪比，使粒子中共同部分的结构信息得到加强，最后对各种不同投影方向的单颗粒电子显微图像在三维空间中进行重构，从而获得单颗粒大分子的三维结构信息。
2 制样方法
2. 1 CET 的冷冻制样
虽然在过去的这么多年中传统制样方法已经证明了其在电镜领域的作用，但是在脱水和固定这样的关键步骤上仍然引起人们的关注。这使得在 20世纪 80 年代形成了一种被称为冷冻制样的替代方法。在冷冻电镜中，样品仍然维持其含水状态，只是使液态水变成了非冰晶态的玻璃态。在整个实验过程中包括 TEM 成像，样品必须保持低于不透明的水温之下（ -135 ℃） .在样品的制备中，由于冰晶会破坏生物结构，所以可利用提高冷却率来阻止冰晶的形成。液体冷冻剂（ 液体乙烷） 可以提供足够的冷却速率来实现水的玻璃化，冷冻深度大约可达到1 μm.对一些厚度较大的样品，样品的玻璃化通常需要其他方式实现。最常用的是高压冷冻（ HPF） 方法： 压力在数毫秒之内达到 200 MPa.这种方法可以使样品表面下 100 ~ 300 μm 内实现玻璃化[15].
随后玻璃化部分（ 25 ~ 100 nm） 必须用冷冻超微切片机切割，并在冷冻电镜下观察，整个过程中样品必须保持在冷冻状态[16].聚焦离子束铣削（ focused-ion beam milling,FIB） 是一种切割超薄切片的方法，在削薄冷冻样品中已经表现出其应用，这个方法是用聚焦离子去侵蚀样品直到达到所需的厚度[17].但在铣削这个过程中大部分样品会丢失。FIB 最大的优势是可以得到足够薄的样品切片且没有由于切割而引起的结构损害。FIB 铣削在那些可以牺牲大部分样品且不影响研究结果的情况下可以取代冷冻切片。
冷冻固定后的样品也可以进行常规处理。冷冻置换（ freeze substitute） 是在低温下用包含固定液和染色溶液的有机溶剂将冷冻组织的水逐渐溶解的一个过程[18].然后再进行传统的包埋、切片等步骤。这种方法在细致结构的保护上也有较好效果，而且降低了冷冻切片和冷冻电镜下观察样品带来的技术要求。
2. 2 单颗粒制样
首先用溶剂溶解膜蛋白提取膜蛋白溶液，经过多次纯化后得到高浓度的膜蛋白溶液。快速冷冻制样方法是将含有生物大分子样品的溶液分散在含有微孔的碳支撑膜上，利用滤纸吸去多余的液体使得支撑膜表面形成一层非常薄的溶液，然后将其以非常快的速度浸入到被液氮冷却的冷冻剂如液态乙烷中。液态乙烷的高热容保证了样品温度快速下降并防止冰晶的产生，样品中的水形成了一种非晶态的冰，然后样品在低温条件下被送入到冷冻电镜中观察。在样品进入电镜之前为了增加样品对电子的耐受性，样品可以进行负染或者进行冷冻制样。这两种方法都有自己的优缺点[19,20].
3 三维重构。
3. 1 电子断层成像三维重构
在倾斜图像收集过程，倾斜角度通常达到最大，单轴倾斜角度为 75°的分辨率大约和双轴倾斜角度60°时的分辨率相同。但倾斜角在 60° ~ 70°时只有厚度较小的样品才可以使用，因为在高角度时由于样品的厚度迅速地增加导致图像的质量降低。因此在 60° ~70°时使用双轴倾斜可以提高图像的质量。冷冻样品采样过程是对同一个区域进行照射，而冷冻含水样品存在的一个问题就是对电子敏感性特别高，高通量的电子照射往往损害样品的超微结构。因此为了防止样品细节丢失或者结构的变形，总电子剂量必须控制在 80 ~100 e-/ ?2之下。
三维重构前的第一步是图像的对齐。图像的对齐是通过旋转、转换和放大修正等过程来实现。对齐中最常用方法是利用样品中的胶体金或者支持膜来定位，胶体金必须足够大以至于在图像中能清晰看到，理想直径为 10 ~ 20 nm.但这也并不是唯一的标准，如果所要检测的蛋白颗粒接近胶体金直径，应该适当地调整胶体金颗粒。对齐过程中所选用的胶体金标记最少应在 8 ~10 个并且均匀分布在图像中。然而有时很少的胶体金也能产生较好的效果，对齐的准确度通常随着胶体金个数的增加而增加，理想的对齐是每个胶体金都能在整个倾斜系列中被跟踪，但是大多数的对齐程序都能适应部分胶体金的缺失。总之，在对齐过程中，胶体金对于低电子密度图像极其重要，胶体金是倾斜图像跟踪的最明显特征。
分析电子断层重构数据的第一步是分析 z 轴的2D 倾斜图片，这个方向的图片特征更加明显。体渲染和表面渲染是两种重要的断层数据展示方法。体渲染是把立体强度转换成透明值，然后转换成亮度。它的优点是利用了所有的数据，避免了主观分割。
透明化后的缺点来自于样品结构的重叠导致对其结构分析变得很困难。体渲染对于子结构的重构非常有用。而由于表面渲染减小了视觉上的物理差距，因此表面渲染更加常用一些。
分割是重构数据展示过程中最重要且最耗时的一个过程，包括手动分割、自动分割和半自动分割。最简单的方法是手动分割，但手动分割耗时多且主观性较强。半自动分割减少了实验者的工作量，但由于冷冻含水样品的低信噪比和低对比度增加了半自动分割的难度，目前很多软件正在克服这些难点。自动分割是利用密度阈值设置一个表面的等值面。
对于有较好对比度的样品时可以取得较好的效果，但背景较复杂和低对比度的样品时，通常需要设定多个阈值。模板匹配是基于对靶结构了解的基础上对目标进行分割[21 ~23],X 射线晶体学或者单颗粒方法可以得到分辨率较高的细致结构，因此结合高分辨率的样品对断层进行分割是一种比较实用的方法。
3. 2 子断层数据的单颗粒三维重构
单颗粒分析由三部分组成，分别为子断层照片的提取，对齐（ 3D 旋转和转换的应用） 和计算平均值。为了方便子断层照片后期的 3D 对齐过程，提取的子断层照片必须以立体的形式呈现。如果所选择的蛋白有一个较长的形状，必须选择一个包含多个膜蛋白的边界框。操作过程必须按照以下步骤进行，对于每一个坐标的三联体，计算左上角且提取子断层照片。在对齐之前，大部分断层照片需要逆转对比度和像素值。在对齐过程中，降低 3D 参考物的影响有： （ 1） 在 3D 对齐过程中使用几种不同的参考直至出现的结果较稳定。（ 2） 挑选的颗粒最好在中心位置。因此 3D 旋转对齐计算出的平均值可以作为下一次 3D 对齐的参考物。在对齐整个子断层照片过程中，为了修正子断层照片的方向和位置需要进行一系列连续的旋转和对齐操作。每次 3D 对齐循环结束后计算出平均值作为下一次循环的参考。现在一些软件都能很好地处理单颗粒的三维对齐过程[24 ~26].
3. 3 单颗粒的三维重构
单颗粒的三维重构主要包括以下几方面： 评估图像； 反差转换函数（ contrast transfer function,CTF）校正； 颗粒的选择； 2D 分析； 生成初始模型； 模型精修。（ 1） 评估图像。在选择颗粒之前，首先要对图像质量进行初步评估，最少要保证有 30 ~50 张图像可以使用。尽管低分辨率的重构对散光和漂移的要求并不是很高，但为了避免假象出现，还应该尽量选择高质量的图像。有经验的实验者可以根据经验直接选择高质量的图片，而客观的评估方法可以通过检测每张图片的傅里叶变换参数来进行判断。评估的第一步是观察颗粒在图像中的对比度。颗粒清晰并且相互分离的最好，但不可避免会出现颗粒的重叠； 颗粒不清晰和远离焦点的图像不能使用。（ 2）颗粒的选择。在颗粒选择之前，需要统一调整原始图像平均值和标准差，并且反转图像的对比度。选择颗粒方法包括手动选择和半自动选择。在高质量的电镜图片中对比度较高的颗粒至少应在1 000 ~2 000个之间。（ 3 ） 2D 分析。在 2D 分析中可以使用初始分析方法来筛选或者进一步的缩减样本量，然后再进行颗粒的归类平均，如果效果不好可以重新进行颗粒选择。低分辨率的重构应该保持在2 000 ~ 3 000个颗粒，非均一的颗粒应该在5 000个。（ 4） 生成初始模型。有很多方法可以生成最初的颗粒模型，而生成初始模型的方法也存在很多争议。各种方法都有自己的优缺点，但一个模型经过几次细化以后，往往都能生成让我们满意的初始模型。如果一种方法并不能得到初始模型，有可能是由于蛋白颗粒中包含不均一的结构。在这种情况下可以考虑使用其他实验方法进行验证。（ 5） 模型精修。初始模型生成后，基本重构已完成，但精细模型还是一个耗时较多的过程。在生成低分辨率的三维重构时，可以不进行 CTF 矫正过程，虽然会存在一定的扭曲，但并不会影响颗粒的总体结构。现在已经有很多软件包可以完成单颗粒三维重构过程，如EMAN,Direx,Xmipp,Relion,Frealign.
4 展望
膜蛋白作为生物蛋白中一种重要的结构蛋白，由于其所具有的重要位置，这些年已成为蛋白结构研究的重要领域。单颗粒方法和电子断层成像是研究膜蛋白的两种主要的方法，电子断层成像技术与其他的结构分析技术相比，最大的优点是可以对非均质的蛋白复合物、细胞器、细胞以及镶嵌在膜上的膜蛋白原位精细结构研究，被认为是研究原位结构的唯一方法。但电子断层成像技术作为一个新兴的学科，还处于发展和完善阶段，无论在理论上还是实践中仍有很多工作需要完成，其中自动化数据收集和处理以及提高重构分辨率是电子断层成像两个重要发展方向。单颗粒方法主要研究具有全同性或对称性的蛋白结构，其通过大量的平均化可以得到高分辨率的结构蛋白。但由于蛋白脱离细胞环境，其结构和原位结构相比不可避免会发生改变。随着冷冻断层成像技术的不断改善，通过这两种方法相互结合的使用，膜蛋白的结构研究将取得一个巨大的进步。
参考文献：
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[4] Eibauer M,Hoffmann C,Plitzko J M,et al. Unravelingthe structure of membrane proteins in situ by transferfunction corrected cryo-electron tomography[J]. Journalof Structural Biology,2012,180（ 3） : 488 - 496.
