基于核酸适配体的SPE技术研究新成果

　　摘要：核酸适配体是一种经由体外指数级富集系统进化技术筛选得到的随机寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段能特异性结合靶物质。核酸适配体与固相萃取技术相结合，可以高选择性地应用于复杂样品中痕量组分的萃取、分离、富集和纯化，由此引起了广泛关注。该文综述了基于核酸适配体的固相萃取研究进展，着重评述了核酸适配体固相萃取柱的制备、固相萃取过程、面临的问题和应用前景。
　　
　　关键词：固相萃取；样品前处理；亲和吸附；核酸适配体；复杂样品；综述。
　　
　　Abstract:Aptamers are short single-stranded oligonucleotides within randomly synthesizednucleic acid libraries by a systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Because ofspecific identification for target molecule,solid phase extraction technique based on aptamersexhibits great potential for extraction,separation,purification and enrichment of trace-targetanalytes from complex samples,and it attracts more and more attention. This article brings acomprehensive survey of recent developments of solid phase extraction techniques based onaptamers,including the preparation of aptamer-based sorbents,the solid phase extraction pro-cedure and the applications of aptamer-based solid phase extraction. Limits and prospects foraptamer-based solid phase extraction are also discussed.
　　
　　Key words:solid phase extraction （SPE）；sample pretreatment;affinity adsorption;aptamer;complex sample;review.
　　
　　固相萃取（solid phase extraction,SPE）[1]因其易于实现自动化和灵活性高的特点，被广泛应用于分离和富集过程，已被认为是分析测试前对样品进行前处理的标准方法之一。SPE 利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标分析物，使其与样品基质和干扰物分离，再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标分析物的目的。使用 SPE 吸附富集可大大增强分析物的检出能力，提高待测组分的回收率。SPE 方法中固体吸附剂的选择是决定萃取效率、富集倍数和吸附材料使用寿命的重要因素。然而传统的 SPE 吸附材料（如 C8、C18等）具有萃取选择性低的缺点，难以高效地用于复杂样品中痕量目标分析物的萃取和富集。
　　
　　为提高 SPE 材料的选择性，一系列基于“分子识别”的功能化吸附剂被研发出来，主要包括基于抗 体[2]、分 子 印 迹 技 术[3]以 及 核 酸 适 配 体（aptamer）[4]的吸附材料。其中，基于抗体的吸附材料特异性强，但抗体的获得费时且昂贵[2].分子印迹聚合物制备方便，然而模板的洗脱费时且难以达到洗脱完全的效果[3].
　　
　　近年来，已有不少研究以核酸适配体作为亲和配基应用于 SPE,并获得了很好的效果。核酸适配体是一种经由体外指数级富集系统进化（systema-tic evolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX）[5]技术筛选得到的随机寡核苷酸片段，可以是 DNA 或 RNA,能特异性结合靶物质。核酸适配体可通过分子内的相互作用，如氢键、碱基互补配对等，形成多种三维空间结构，包括发夹、凸环、假结和 G 四联体结构等。依据这种三维空间结构，核酸适配体可以广泛地与目标结合，从金属离子[6]到小分子[7]、大分子蛋白质[8],乃至整个细胞[9].核酸适配体又被称为“化学抗体”,但与抗体不同的是，核酸适配体可以大批量体外合成，这使核酸适配体在生物化学分析领域有更广泛的应用空间。
　　
　　由于基于核酸适配体功能化材料的 SPE 方法具有高选择性和高特异性的特点，近年来受到广泛关注。本文着重综述基于核酸适配体的 SPE 技术研究进展，对基于核酸适配体的 SPE 材料的制备、SPE 过程、应用、面临的问题和前景进行综述。
　　
　　1 基于核酸适配体的固相萃取吸附剂。
　　
　　基于核酸适配体的 SPE 技术的核心是制备基于核酸适配体的吸附材料，这其中涉及固相载体的选择和活化、适配体的修饰及其在载体表面的固定。
　　
　　1.1 载体的选择。
　　
　　选择合适的载体材料用于核酸适配体的固定对于基于核酸适配体的吸附剂的制备是很重要的环节。此载体材料需要具备以下属性：（1）化学/ 生物惰性，以便在 SPE 过程中不与分析物或基质产生化学反应；（2）能够在一定程度上耐受酸碱及有机溶剂，这样可以在选择上样和洗脱溶液时不受载体的局限；（3）良好的机械稳定性，以及均一的粒径和形态；（4）由于需要进一步在此材料表面固定核酸适配体，所以此载体材料的表面最好容易活化；（5）亲水的表面，这样可以最大限度地减小由载体造成的非特异性吸附。目前常用的载体材料有硅[10]、琼脂糖[11]、凝胶[12]、聚苯乙烯[13]、有机或金属聚合物骨架[4]等。载体的种类会影响 SPE 的表现，Madru等[14]报道了一种基于核酸适配体的 SPE 柱，是以溴化氰活化的凝胶作为载体，并对比了多种载体，包括链霉亲和素活化的琼脂糖、巯基活化的凝胶以及戊二醛活化的凝胶，结果显示以溴化氰活化的凝胶为载体的吸附剂对目标分析物的保留、选择性、吸附容量以及重复性等参数最佳。
　　
　　1.2 间隔体的选择。
　　
　　间隔体（spacer）是指核酸适配体与载体之间的间隔连接体，它会在载体材料的表面与适配体之间产生一个化学间隔，以便二者的间隔臂（arm）相连接。间隔体能够影响核酸适配体在载体材料表面的固定密度、载体表面的性质，进而对 SPE 柱的吸附容量和吸附选择性产生影响[15].随着间隔体长度的增加，核酸适配体在载体表面的密度下降，与此同时核酸适配体在空间上更易接近目标分析物，会导致 SPE 柱对目标分析物的捕获效率增加，但吸附容量会有所下降[15,16].Wang 等[17]使用具有防污功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯作为间隔体制备了基于核酸适配体的 SPE 材料，与未使用该间隔体的材料相比，大大提高了捕获血清中 Ramos 细胞的选择性和特异性。常用的间隔体还包括 3-氨丙基三乙氧基硅烷[18,19]、烷基链[14]、聚乙二醇[13,16]等。
　　
　　1.3 适配体在载体表面的固定。
　　
　　固定核酸适配体的方法包括非共价键和共价键两种形式。非共价键的方法常采用经典的生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素桥连的方法。该方法很容易构建，并且可买到商业化的相关材料，比如链霉亲和素或亲和素包被的磁珠、多孔硅胶以及聚苯乙烯球等。这种非共价键的方法有很高的效率，并且可以维持材料表面的生物相容性，最大限度地维持核酸适配体的结合能力，已被广泛用于包括 SPE在内的分离材料和生物芯片的制备中。该方法操作简单，通常将生物素修饰的核酸适配体与链霉亲和素[11,14]或亲和素[20,21]包被的载体材料混合。但这种方法也有一些缺点，比如重复利用率低、材料的寿命短，尤其当使用有机物修饰的载体材料或者使用高比例有机溶剂作洗脱溶液时，有机材料或有机溶剂会影响生物素与链霉亲和素之间的作用力[11].有研究[18]曾采用生物素-链霉亲和素连接对比共价连接的方式固定核酸适配体，制备了两种基于核酸适配体的固相微萃取（solid phase microextrac-tion,SPME）纤维，并对比二者在萃取腺苷时的表现，结果显示以非共价方式固定核酸适配体制备的SPME 纤维吸附性能不及共价方式制备的 SPME纤维。