生物质炭钝化修复Cd污染土壤的微生物机制(3)

　　2.4   不同处理下土壤团聚体微生物碳源利用特征主成分分析
　　
　　为了进一步了解不同处理下土壤微生物的碳源利用能力的差异，对不同土壤团聚体中各处理120h下31类碳源进行主成分分析（PCA）。经分析，6个团聚体中31类碳源中均提取了不少于7个的与土壤微生物碳源利用相关的主成分，累积方差贡献率均大于90%.由于主成分1（PC1）、主成分2（PC2）的方差贡献率较其余主成分大，各粒径土壤团聚体中都选取这2个能聚集单一碳源的变量数据变异主成分作图剖析。
　　
　　表3可知，>5mm土壤团聚体中，对PC1贡献大的（特征向量系数>0.5）有4种碳源化合物，分别是氨基酸类（L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸）、羧酸类（D-半乳糖醛酸、D-苹果酸）、胺类（腐胺）和聚合物类（吐温40）。对PC2贡献大的碳源化合物有3种，糖类（i-赤藓糖醇、D-甘露醇、N-乙酰D-葡萄糖氨、D-纤维二糖、a-D-乳糖）、羧酸类（D-半乳糖酸r内酯、D-半乳糖醛酸、a-丁酮酸）和胺类（苯乙胺）。PC1和PC2共占微生物群落碳源利用率总变异的38.35%,是变异的主要来源。4种处理组土壤微生物在羧酸类、糖类和胺类的利用上差异显着；5~2mm中对PC1贡献大的有5种碳源化合物，糖类（i-赤藓糖醇、a-D-乳糖）、羧酸类（衣康酸、a-丁酮酸）、胺类（苯乙胺）、氨基酸类（L-苯丙氨酸）和其他类（1-磷酸葡萄糖）。对PC2贡献大的碳源化合物有糖类（D-木糖-戊醛糖）、羧酸类（4-羟基苯甲酸）、胺类（腐胺）和其他类（D,L-a磷酸甘油）。2个主成分占总变异的35.87%,糖类、羧酸类、胺类是促使4个处理产生差异的主要碳源化合物；2~1mm中糖类（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纤维二糖）、聚合物类（吐温40、吐温80、a-环式糊精、肝糖）、羧酸类（r-羟丁酸、D-苹果酸）、氨基酸类（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺类（腐胺）和其他类（1-磷酸葡萄糖）对PC1贡献大。糖类（β-甲基-D-葡萄糖苷、a-D-乳糖）、聚合物类（吐温40、肝糖）、氨基酸类（L-天门冬酰胺、L-苏氨酸）和胺类（苯乙胺）对PC2贡献大。2个主成分占总变异的43.81%,糖类、聚合物类、氨基酸类和胺类碳源化合物导致4个处理碳源利用差异明显，而聚合物类4种全部碳源均对2个主成分贡献突出，是差异产生的主控因子；1~0.5mm中4类碳源化合物对PC1贡献大，羧酸类（D-半乳糖酸r内酯、2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、r-羟丁酸）、糖类（i-赤藓糖醇、D-甘露醇、D-纤维二糖）、氨基酸类（L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-苏氨酸）和聚合物类（肝糖）。对PC2贡献大的有羧酸类（D-半乳糖酸r内酯、D-半乳糖醛酸、衣康酸）、氨基酸类（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺类（苯乙胺）。2个主成分占总变异的37.56%,4个处理碳源利用差异显着的关键因子是羧酸、氨基酸2类碳源化合物；0.5~0.25mm土壤团聚中，PC1贡献大的有4类碳源化合物，羧酸类（2-羟基苯甲酸、a-丁酮酸）、糖类（D-木糖-戊醛糖、i-赤藓糖醇）、胺类（苯乙胺）和聚合物类（吐温80）。PC2贡献大的有3类碳源化合物，羧酸类（D-半乳糖酸r内酯、D-半乳糖醛酸）、聚合物类（吐温40、吐温80）、其他类（1-磷酸葡萄糖、D,L-a磷酸甘油）。2个主成分占总变异的33.34%,羧酸类、聚合物类碳源化合物致使4个处理碳源利用差异显着；<0.25mm中糖类（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、D-纤维二糖、a-D-乳糖）、羧酸类（D-半乳糖醛酸、4-羟基苯甲酸、D-苹果酸）、氨基酸类（L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸）、聚合物类（吐温40）和其他类（丙酮酸甲酯）对PC1贡献大。糖类（i-赤藓糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纤维二糖、a-D-乳糖）、羧酸类（D-半乳糖酸r内酯、a-丁酮酸）对PC2贡献大。2个主成分占总变异的45.80%,4个处理在糖类与羧酸类碳源化合物的利用上差异明显。综上，羧酸类、糖类是4个处理之间碳源利用能力差异显着的主要影响因子。图3坐标轴上，各粒径土壤团聚体中B0与B2.5、B10 2个处理组之间分异最明显，因而，生物质炭处理组与单施Cd处理组碳源利用上起区分作用的是羧酸类和糖类碳源化合物。
　　
　　3   讨论
　　
　　土壤环境质量的评价指标包括土壤微生物种群特征、代谢活性和功能多样性。本文研究显示，各土壤团聚体中微生物的整体代谢活性、功能多样性、碳源利用特征4个处理均呈现B2.5>B10>CK>B0的趋势，表明重金属Cd胁迫下土壤微生物的代谢功能多样性明显降低，生物质炭转变土壤微生物的代谢模式，缓解并提升功能多样性，尤其2.5%低质量分数的生物质炭添加量提升效果最显着。重金属Cd、Cu污染条件下木炭等改良剂修复可改善土壤微生物群落代谢功能多样性[18]证实了本文研究结论。土壤微生物只能利用生物质炭一小部分易分解的碳源[19],因而生物质炭中C组分对Cd污染条件下土壤微生物的功能多样性变化影响并不显着。一方面，生物质炭物理结构空间大直接吸附土壤微生物于孔隙中，成为土壤微生物生活的载体，同时供给N、P、K、Ca等土壤微生物生长代谢必不可少的营养元素；另一方面，生物质炭可通过吸附土壤中的重金属Cd,降低其生物毒性，对土壤微生物产生保护作用。张阳阳等[20]的研究结果也为此做了辅证。但土壤微生物的丰度、Cd消减效果这2者与生物质炭添加量并不一定成正比例关系。生物质炭施用量高，土壤微生物生物量碳反而低[21],尤其易阻碍低养分土壤中固氮菌的生长[22].重金属Cd污染稻田经生物质炭修复后，1%低质量分数生物质炭用量下土壤中有效态Cd显着下降，稻粒中Cd含量也随之降低[23].本文中生物质炭添加量和生物质炭对土壤微生物功能多样性提升效果未呈直接线性关系，可能是实验供试土壤为红壤，养分含量低，2.5%低质量分数生物质炭用量下微生物丰度更高，且能更有效的降低Cd的微生物有效性。然而，生物质炭添加量并不是Cd污染条件下土壤微生物功能多样性提升的唯一制约因子，还可能与土壤养分变动息息相关，它受土壤有机质、N、P、K含量所制约[24].
　　
　　土壤团聚体粒径大小对微生物多样性和群落结构比p H值等其它因素有更大影响[25],微生物代谢功能多样性因土壤团聚体粒径大小不同表现出差异。本研究表明各处理下土壤微生物的整体代谢活性、功能多样性、碳源利用特征峰值均在5~1mm、<0.25mm粒径团聚体中，谷值均在1~0.5mm粒径团聚体中。土壤微生物代谢功能多样性在不同团聚体中呈“V”型分布，分析其原因。首先，土壤大团聚体中生物质炭通过改善土壤团聚体理化性质，提高营养物质含量，直接影响微生物的代谢功能多样性。土壤中有机质的含量随团聚体直径的增大逐渐递增[26],为大团聚体微生物提供充足的养分。土壤微生物功能多样性与土壤总有机碳含量呈极显着的正相关关系[27].安艳等[28]研究表明，生物质炭输入后有机碳含量在5~1mm粒级团聚体中大幅增加。土壤团聚体含量增加可改善土壤结构和碳汇能力。有研究就显示生物质炭施用到红壤后，>1mm粒级团聚体含量呈增加趋势，土壤总有机碳在大团聚体中分配的比例也随之增加[29].本文5~0.25mm大团聚体中土壤微生物代谢功能多样性与团聚体粒径大小呈负相关，这可能是因为有机质、有机碳等微生物可利用底物含量，随着团聚体粒级的减小而逐渐减少。其次，土壤微团聚体中生物质炭钝化重金属Cd,降低生物有效性间接影响微生物代谢功能多样性。生物质炭钝化作用受不同粒级团聚体重金属的富集特征束缚。微团聚体的外源Cd含量占全土中Cd含量的91.0%,微团聚体是Cd的主要富集场所[30].5~0.25mm大团聚体土壤微生物代谢功能多样性呈下降趋势，<0.25mm微团聚体中又大幅回升。这是Cd大量分布在微团聚体中，生物质炭Cd钝化效果比大团聚体更显着所致。最后，土壤微生物功能多样性还受微生物本身情况约束。2~0.25mm团聚中细菌、放线菌和微生 物 总 量 随 团 聚 体 粒 径 增 大 逐 渐 增 加，而<0.25mm团聚体中随粒径的减小呈减少趋势[31].5~1mm大团聚体中土壤微生物数量规模较大造成总体微生物碳源利用、代谢强度大，代谢功能多样性高。<0.25mm微团聚体中土壤微生物数量规模小，但生物质炭很大程度恢复Cd毒害的微生物代谢功能多样性。文中<0.25mm的微团聚体中与其余3组处理相比，单施Cd的B0处理组微生物整体代谢活性明显降低，生物质炭对功能多样性、6类碳源化合物利用率的提升效果显着。B0与CK空白对照碳源利用能力大团聚体中相似，微团聚体中则大相径庭。这些现象均与上述原因紧密相关，当然，不同种类土壤微生物的团聚体空间分异特征及其对各类碳源利用的选择性也是其影响因子之一。
　　
　　3种土壤功能多样性指数解析阐明，Cd污染土壤中微生物群落物种的均一度对生物质炭响应最灵敏，群落中常见的微生物物种却没有太大响应。张仕颖等[32]研究显示，有机农药输入后土壤微生物的碳源利用能力集中，Simpson指数升高。研究中Simpson指数基本无变化，微生物对碳源利用能力均一，微生物分布均匀所以微生物均一度指数高。6类碳源化合物分析可得，重金属Cd胁迫下土壤微生物偏好于其他类碳源化合物。低等程度有机污染刺激土壤中微生物利用胺/氨基化合物[33].重金属复合污染程度与土壤微生物多样性不完全呈负相关，中等污染程度多样性指数高，微生物种群结构发生变化，某些抗重金属菌群出现[34].本实验外源Cd的用量为2.5mg/kg,模拟的是中低浓度Cd污染条件。耐Cd的抗性菌株在中低浓度污染的刺激下形成，且对其他类碳源具有偏嗜性。主成分分析表示，生物质炭处理组与单施Cd处理组碳源利用上起区分作用的是羧酸类和糖类碳源化合物。有实验表明，重金属污染条件下，糖类、羧酸类和氨基酸类3类化合物对土壤微生物的代谢模式起分异作用[35],这与本文结果较相似。本文利用Biolog微平板法探究外源Cd条件下生物质炭输入后不同粒级团聚体微生物在碳源代谢功能多样性方面的响应机制。Biolog板中碳源底物种类有限，而土壤微生物的数量庞大，种类繁多，研究中所得代谢多样性类型不一定反映整个土壤微生物多样性，只代表了可培养微生物。生物质炭-重金属Cd的耦合作用下，土壤微生物在微团聚体中的变化趋势及规律同样错综复杂，本研究对微团聚体中微生物多样性探究尚未深入。因而有必要把研究视角切换到分子生物学上进一步深入探究土壤微团聚体中微生物的种群结构及多样性。