粗线前期 piRNA 与粗线期 piRNA[5,37].piRNA 序列包含重复序列、来自基因间和基因区域的序列，由此大多数 piRNAs 定位于基因组的簇集位点，存在于遗传序列之间、遗传序列内部以及外部。粗线前期 piRNA 富含重复序列，主要与 MIWI2 和 MILI 两种蛋白结合 ;而粗线期 piRNA 大多是基因间 DNA编码的序列，主要与 MILI 和 MIWI 蛋白结合，这一类分子通常出现在精母细胞的粗线期和圆形精细胞中[34,38-41].在刚出生几天小鼠的睾丸组织中主要发现的是粗线前期piRNA,在产后14.5 d小鼠体内发现，精细胞发育进入到第一次减数分裂的粗线期时，粗线期 piRNA 出现[42].有趣的是这些粗线期 piRNA在成年小鼠 piRNA 总量中所占比例高于 95%,转录因子 A-MYB 通过直接调控 piRNA 转录本和参与piRNA 通路的蛋白组件的编码基因来促进起始粗线期 piRNA 的产生[42].piRNA 通路十分复杂，且目前尚未有明确定论。piRNA 通 路 不 同 于 miRNA 路 径， 它 不 依 赖Dicer 酶活动。目前大多认为有两种通路，对初始piRNA 进行初级加工，再通过“乒乓”扩增效应机制扩增 piRNA 且 piwi 蛋白具有酶切活性，由此来促进 piRNA 前体形成 piRNA.在小鼠前精原细胞的粗线前期，piRNA 是仅通过前体初级加工而成的产物，后续在初级精母细胞和次级精母细胞中“乒乓”效应机制是主要的生物途径[43].在初始加工中，piRNA 前体是一条长的单链 RNA,由 piRNA 基因簇转录而来，包括正义链和反义链 ;正义 piRNA前体优先与 MILI 绑定活化转座子元件，反义前体piRNAs 次级加工产物大多与 MIWI2 作用，能在转录水平通过 DNA 甲基化沉默转座子 ;其 5' 端与piwi 蛋白家族成员相连，3' UTR 被剪切产生特异的piRNA[32,38,43,44].关于“乒乓”扩增机制，piwi 蛋白（小鼠中的 MILI）能识别初始 piRNA 前体，在其距离 5' 端 10th 的位置结合产生切割活性，形成次级piRNA 前体[32,44];在这个位置上次级 piRNA 前体被另一个 piwi 蛋白 MIWI2 识别结合并扩增，扩增出来的则是初始 piRNA 前体又再一次被 MILI 识别进入下一个扩增循环。MILI 偏向于与初始 piRNA 前体结合，MIWI2 则更易与次级 piRNA 前体结合，在“乒乓”机制中各司其职[40].通过“乒乓”循环同时产生的 piRNA,转座子转录本由 piRNA 诱导的沉默复合体降解[44,45],这个机制只有在初生小鼠的睾丸组织中能观察到，而成年小鼠中却没有，成年小鼠中MIWI2 不表达，说明 MILI 和 MIWI 涉及 piRNA 的初始加工[46].
3 sncRNA对雄性动物生育能力的影响
物种的起源和自我维护会依靠一种生殖隔离机制，即排斥与其他物种进行基因交流。其中一种生殖隔离机制的表现形式是雄性不育，许多自然杂交的后代可以存活，但是其雄性个体往往表现为完全不育或者部分不育。杂种雄性不育个体通常在两个水平上发育受到影响 :一是性腺发育 ;二是精子形成。性腺发育受阻，不能发育成完整的睾丸因此表现为雄性不育，或是产生较小的睾丸进而有可能导致产生精子数量偏少。精子形成水平上一般存在两方面问题，一是生精过程受阻导致产生的精子数量不足或不产生精子 ;二是产生异常精子。sncRNA 会调控精子的形成对雄性动物的生育能力产生影响。
这方面的研究开始于睾丸组织切片、精子形态数量的观察研究，并逐步从组织形态观察过度到分子层面的研究，大量研究表明挖掘雄性不育的机理更有助于了解或解决雄性不育的问题。目前对精子形成过程中的 sncRNA 研究已初见成就，下面主要描述 3种 miRNA,即 miR-122、miRNA-383、mir146,在雄性不育精子形成过程中的研究进展。
精子异常是雄性不育的主要因素，其发病机理仍不明确。MicroRNA 在不育男性患者异常精子中的作用还未被研究清楚。Liu 等[46]用人类诱导多能干细胞探究 miR-122 在体外表达对精细胞分化的影响；在诱导以后，用 miR-122 突变体转染已形成细胞的精子，再用流式细胞仪分析细胞形精子的单倍体细胞群中 DNA 含量，miR-122 突变体转染细胞的 DNA含量明显比正常 miR-122 转染细胞的有所增加。诱导过程中，突变体 miR-122 转染细胞中的核转换蛋白 2（TNP2）含量和鱼精蛋白的 mRNA、蛋白水平含量都比正常 miR-122 转染细胞中的要高[47].对两组转染的细胞进行蛋白质分析，脂蛋白含量存在显着差异。研究表明 miR-122 与精子变形有关，miR-122 可能通过抑制 TNP2 的表达来影响细胞形成精子，并抑制精子发育过程中蛋白质的表达。
最近研究发现 miRNA-383 的异常表达也与雄性不育有关。miRNA-383 的表达在精子成熟性障碍不育男性的睾丸组织中相对下调，但其在精子形成过程中的作用机制和功能还不清楚。Tian 等[47]的研究发现，在小鼠睾丸组织中有 88 种 miRNAs与 X 脆性智力低下蛋白（FMRP）有关，其中也包括 miRNA-383.敲除Fmr1基因（X 脆性智力低下蛋白基因）以后，睾丸畸胎瘤细胞（NT-2）中FMRP 变低，miRNA-383 对细胞增殖的抑制作用增强，FMRP 与 miRNA-383 作用大幅度减少，影响miRNA-383 与靶基因 3'-UTR 区的结合，比如，干扰素调节因子 1（IRF1）和细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）mRNA 的 3'-UTR 区。 另 一 方 面， 精 原 细 胞和 NT-2 中 miRNA-383 的过度表达能下调 FMRP 的水平含量。miRNA-383 直接与细胞周期蛋白 D1 结合，抑制其基因的下游效应元件，减少 FMRP 的表达。在 FMRP 下调表达的病人和敲除Fmr1基因的小鼠睾丸中都有发现，降低 miRNA-383 的表达，miRNA-383 的下游基因表达异常。通常认为在精子形成过程中 FMRP 和 miRNA-383 之间可能存在一种反馈链，FMRP 对 miRNA-383 的功能起负调控作用。
FMRP 通过与 miRNA-383 和它的靶位 IRF1/ CyclinD1 结合来影响 miRNA-383 与其 3'-UTR 作用并调控miRNA-383 的功能。Huszar 等[48]发现 mir146 生物合成受阻会破坏精子形成从而导致雄性小鼠不育，此外还发现小鼠体内 mir146 高度调节精原细胞的分化，这个过程有赖于视黄酸信号。相对于分化的精原细胞，mir146在未分化的精原细胞中含量较高，mir146 直接作用靶标是中间复合体 1,mir146 与中间复合体亚基 1（一种类维生素 A 受体的辅助调节因子）的 3' UTR 区结合。mir146 的表达水平会影响精原细胞转录本的水平，一般过分表达会减少精原细胞过程中的转录本水平，如在未分化的精原细胞中 mir146 过分表达会减少中间复合体 1 转录本和蛋白水平，反之，抑制mir146 会影响精原细胞分化的相关基因表达上调，这样培养的细胞往往不能正常分化为精子，可能导致细胞凋亡。体外暴露在视黄酸下的雄性生殖细胞会诱导精原细胞的分化及后来精母细胞的减数分裂。
研究发现暴露在视黄酸条件下的精原细胞 mir146 会被下调，精原细胞在转录水平上响应视黄酸诱导而促进分化，生殖细胞成分中已分化精细胞趋于含量更低，由此看来在分化过程中依靠视黄酸信号来调节精细胞的分化过程。
国内对动物 sncRNA 方面的研究亦随着小分子 RNA 研究的兴起而逐渐被重视，有研究者利用动物模型对 sncRNA 在精原干细胞分化过程中的作用或生殖干细胞中的表达做了一定的研究。例如，在 miR-34 家族中的 miR-34c,在细胞内的多个过程中都有作用，对精子发生过程也有重要的调控作用。Nanos 是一类进化保守的 RNA 结合蛋白，在生殖细胞（包括原始生殖细胞和生殖干细胞）发育中发挥功能。在小鼠中，Nanos2 在精原干细胞中表达，在精子发生过程中具有维持干细胞多能性的作用。于萌等[49]以 miR-34c 作为研究对象，预测发现 Nanos2 是 miR-34c 的靶基因之一，构建其双荧光素酶报告基因载体及双荧光素酶报告基因突变载体验证靶基因，通过在分离的原代及传代精原干细胞中转染合成的 miRNA 模拟物、抑制物，及使用含有 miR-34c 慢病毒颗粒转导小鼠的曲细精管，检测、分析生殖细胞分化特异性标志基因的变化，深入研究了 miR-34c 对生殖细胞分化特异性标志基因的调控作用，研究结果证实 miR-34c 可能会通过靶向 Nanos2 以促进精原干细胞的分化。徐璐等[50]
以原始生殖细胞和精原干细胞为细胞模型，利用 Real-time qPCR 技术检测了 Piwil1 基因在如皋黄鸡生殖系干细胞中的相对表达量。结果表明，Piwil1 基因在生殖系细胞中特异性表达，且 Piwil1 基因在精原干细胞中的表达量显着高于原始生殖细胞，这表明Piwil1 基因可能在精原干细胞的“DNA 重新甲基化”以及自我更新过程中发挥重要作用。
精子的形成过程是雄性不育研究的重点，但是目前都还处于起步阶段，很多机理及作用机制还未研究清楚，也许将来这方面会成为 sncRNA 的研究热点，同时也对雄性问题不育研究提供参考，有望解决动物遗传育种方面的雄性不育问题。
4 在动物遗传育种中应用
杂种雄性不育在物种间是一种普遍的生殖隔离现象，然而很少知道导致这种不育现象的发生原因，尤其是在自然杂交的物种中。为探究雄性不育的原因，Lisa 等[51]以蟾蜍为研究对象，使美国西南部地方的平地蟾蜍和墨西哥蟾蜍杂交得到杂交后代发现，杂种后代可以存活，但雄性杂交后代生育能力降低。比较杂交后代和正常蟾蜍的睾丸大小和不同发育阶段生殖细胞的形成状态发现，杂交雄性后代的睾丸大小与纯种的不同，杂交个体中睾丸大小变异范围比较大。精细胞形成早期阶段数目与纯种相似，但是成熟精子的形成明显少于纯种的。渗入过其他物种基因的个体产生的精细胞要么异常畸形要么不具游动性。这些结果表明，杂种的不相容性在精子的后期发育中也是种间繁殖的屏障。类似的试验在国内也曾做过，余劲聪等[52]在牦牛和杂交后代犏牛上做过组织形态学、精子发生过程研究。犏牛，即牦牛和普通黄牛的杂种。牦牛主要分布于以青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高山地区的特有牛种，对高寒草地的生态环境有极强的适应性，在空气稀薄、牧草生长期短、寒冷和枯草期长的恶劣环境下生活自如，繁衍后代，为当地牧民提供奶、肉、毛、役力及燃料等生产、生活必需品，是当地不可或缺的畜牧业经济[53].但是繁殖能力在 2 年一胎或3 年一胎的水平，无法满足当地牧民的需求，于是想通过牦牛与普通牛杂交得到较高繁殖力、较高产奶量等经济价值较高的杂种牛即犏牛。杂交代（犏牛）产奶量高，但雄性不育，而母犏牛无论与普通牛回交还是与牦牛回交，生产的后代生产性能都低下。若能解决犏牛的雄性不育问题则有助于提高当地畜牧业经济，从而能解决犏牛这种较高经济性状的繁殖问题以满足人类所需。
目前关于 miRNA 通过对关键基因的转录后水平调控来介导精子生成的遗传机制的报道较少，有关动物 miRNAs 基因功能以及与动物繁殖性状相关的miRNAs 也鲜有研究。Chen 等[54]在对水稻细胞质雄性不育系研究中，设计了一个转基因的方法来改善植物的高度和雄性不育系杂交水稻圆锥花序的延伸和培养杂交半矮秆植物。使用方法包括两个部分：
人工 microRNA（amiRNA）和人工靶序列模拟，可以篡改内源性 Eui1 基因（与水稻节间伸长有关）的差异表达。amiRNA 是近年来发展起来具有较高特异性基因沉默的方法，而人工靶序列模拟具有天然抑制 miRNA 功能机制的特点，是最近发展起来的一种方法。这种方法提供了一个范例，通过与 amiRNA结合和人工靶序列模拟技术，调节内源基因的表达和实现所需的表型。
5 展望
综上所述，有望通过对犏牛和普通牛睾丸组织的 sncRNAs 的深入研究解决犏牛的雄性不育问题，可对精子形成过程中研究比较多的 miRNA、piRNA及其靶位进行人工干预。随着研究的不断展开和深入，对于 miRNA 在精子形成中的作用及其机制的阐明，以及利用多种分析预测手段研究 miRNA 与精子形成中各调控蛋白组成的关系，将会使人们对高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平，对 miRNA 作用机制的研究可以为解决雄性不育问题奠定理论基础，也可为未来采用小分子干预生殖调节、治疗生殖相关疾病以及动物育种方面的问题提供新策略。
