披针叶黄华(Thermopsis lanceolata)属豆科(Leguminosae)黄华属多年生草本植物,广泛分布于内蒙古、甘肃、宁夏、青海等省区。多生于滩地、戈壁、石质山坡、流动沙丘等干旱荒漠环境下,其适应范围极广,抗寒性强,在碱化、盐渍化土壤中能生长良好,是防风固沙的优良植物。除了重要的生态价值外,披针叶黄华还具有抗癌、抗心律失调、抗微生物、抗 溃 疡 和 升 高 白 细 胞 等 多 方 面 的 药 理 作用,对 植 物 病 虫 害 的 防 治 也 显 示 出 明 显 的 效果,具有重要的药用价值及开发成新型环保农药的潜力。多年来,许多学者就其药理、临床和化学成分,特别是生物碱及其活性、种子萌发和幼苗生长等方面开展了大量研究,但迄今尚未见从生理生化角度揭示披针叶黄华适应盐环境的相关报道。河西走廊是典型的干旱半干旱区和盐碱区,盐碱地面积大(1.798×106hm2),其盐渍土盐分组成以硫酸盐为主,其次是氯化物-硫酸盐,碳酸 盐较少。本试验以披针叶黄华试管苗为材料,研究不同盐度梯度的NaCl和Na2SO4胁迫下试管苗的生长、脯氨酸、可溶性糖、可溶 性 蛋 白 含 量 和Na+、K+、Ca2+变化规律,比较披针叶黄华对不同盐胁迫的响应差异,从离子平衡和有机溶质的积累等方面初步探讨披针叶黄华适应盐胁迫的渗透调节机制,为进一步高效开发利用披针叶黄华以及在盐碱地的人工栽培提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 材料的培养
将初代培养的披针叶黄华试管苗按单节茎段转移到MS+2.0mg/L KT+0.5mg/L IAA+3%蔗糖+0.9%卡拉胶的培养基中进行培养。培养条件为:pH 5.5~6.0,培养温度(25±2)℃,光照度3 000lx,每天光照14h。
1.2 材料处理
实验选用NaCl和Na2SO4两种中性盐,将继代培养的披针叶黄华试管苗切割成双节茎段转移到0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0% NaCl和Na2SO4的胁迫培养基中进行培养,以不加盐的培养基为对照。每个处理40株,培养方法同上,胁迫培养30d后,取各处理试管苗用于生长指标、渗透调节物质含量和阳离子含量测定。
1.3 生理指标测定
脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法;可溶性糖含量采用蒽酮比色法;可溶性蛋白质含量的检测采用考马斯亮蓝G-250染色法;Na+、K+、Ca2+含量测定采用STOREY的方法,略有改动,按标准溶液配制方法配成待测金属含量为1.000mg/mL的储备液,测定时稀释至所需浓度,制成标准曲线,求出回归方程。取各胁迫浓度处理的试管苗20株,将根和叶分开,烘干至恒重,分别取0.1g材料用硝酸∶高氯酸(4∶1)进行消化处理后,用火焰原子吸收分光光度计测定Na+、K+、Ca2+含量,以去离子水做空白对照。
1.4 数据统计
所有测定均做3次重复,使用Excel 2003和SPSS 19.0进行数据处理和分析,Origin 8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同盐胁迫对披针叶黄华试管苗生长的影响
观察发现,随盐胁迫浓度升高,披针叶黄华试管苗叶片变小变黄,新叶长出的时间逐渐延长,生长明显被抑制;在1.0% NaCl胁迫下,试管苗叶片发黄或部分老叶首先萎蔫干枯脱落,但刚萌发出的新叶较少表现出盐害症状,而相同浓度的Na2SO4胁迫下并未出现叶片干枯脱落现象(图1)。经测定(图2),披针叶黄华试管苗平均株高随着两种盐胁迫浓度的增加而逐渐降低,且Na2SO4胁迫下降低的幅度较小。当盐浓度增为1.0%时,NaCl胁迫组试管苗平均株高仅为对照的19.90%,而Na2SO4胁迫组试管 苗 平 均 株 高 仍 为 对 照 的33.47%。这 表 明NaCl胁迫对披针叶黄华试管苗生长的抑制作用大于Na2SO4,且此效应具有浓度依赖性。【图略】
2.2 NaCl和Na2SO4胁迫对披针叶黄华试管苗叶片有机渗透调节物质含量的影响
如图3,A所示,披针叶黄华试管苗叶片中脯氨酸含量随盐浓度的增加而逐渐增加。其中,0.2%NaCl和0.2%、0.4% Na2SO4胁迫下,试管苗叶片脯氨酸含量与对照没有显着差异(P>0.05);而随着盐浓度继续升高,两种盐胁迫试管苗叶片脯氨酸含量迅速升高,0.4%~1.0%的NaCl胁迫下分别为对照的6.89、8.99、16.69和13.59倍,0.6%~1.0% Na2SO4胁迫下分别为对照的6.75、11.03和12.66倍,且差异均达到极显着水平(P<0.01)。同时,不同浓度盐胁迫下披针叶黄华试管苗可溶性糖含量均比对照显着增加(P<0.05),并随胁迫浓度表现出持续升高的趋势(图3,B)。其中,在0.2%~1.0%的Na2SO4胁迫下,试管苗叶片可溶性糖含量分别为对照1.77、2.36、3.06、3.77和4.10倍;相同浓度的NaCl胁迫下,试管苗叶片可溶性糖含量分别为对照的1.71、1.96、2.14、2.78和3.46倍 。比较而言,Na2SO4胁迫下试管苗叶片中可溶性糖含量的增幅大于相同浓度NaCl胁迫处理。【图略】
另外,披针叶黄华试管苗叶片的可溶性蛋白质含量随着NaCl浓度增加表现出先升高后降低的趋势,而Na2SO4胁迫下则表现出持续升高的趋势(图3,C)。其中,与对照相比,试管苗叶片可溶性蛋白质含量在0.2%和0.4% Na2SO4胁迫下没有显着差异(P>0.05),在0.6%、0.8%和1.0% Na2SO4胁迫下分别显着增加38.75%、48.40%和66.72%;当NaCl浓度为0.6%时,试管苗可溶性蛋白含量最高,比对照显着增加34.83%,而当NaCl浓度增加为1.0%时,可溶性蛋白含量比对照降低2.8%,但未达到显着水平。以上结果说明可溶性糖和可溶性蛋白含量增加有利于试管苗的渗透调节,且总体表现出对Na2SO4胁迫的调节能力强于同浓度NaCl胁迫。
2.3 NaCl和Na2SO4胁迫对披针叶黄华试管苗叶片离子含量及比值的影响
2.3.1 Na+、K+和Ca2+含量 披针叶黄华试管苗叶片与根系中Na+的含量随NaCl和Na2SO4胁迫浓度的 增 加 逐 渐 上 升 且 均 显 着 高 于 对 照 (P<0.05),但叶片中Na+含量明显高于根系,两器官间的差异却随盐胁迫浓度的增加逐渐缩小(图4,A)。其中,叶 片Na+含 量 的 增 幅 在0.2%时 最 大,在0.4%~1.0%间随盐浓度增加逐渐变缓;根系Na+含量在低盐浓度下(≤0.4%)增加比较平缓,但在0.6%~1.0%间却随盐浓度的增加而显着上升。比较两种盐胁迫下试管苗叶片和根系Na+含量的变化发现,NaCl胁迫试管苗叶片Na+含量均比相同浓度Na2SO4胁迫处理高,而其根系Na+含量均比相同浓度Na2SO4胁迫处理低。
由图4,B可知,随NaCl和Na2SO4胁迫浓度的增 加,披针叶黄华试管苗叶片中K+含量逐渐降低,并显着低于对照(P<0.05),且Na2SO4处理始终高于同浓度的NaCl处理;当盐浓度为1.0%时,NaCl和Na2SO4胁迫叶片中K+含量分别比对照显着降低59.6%和44.7%。同时,NaCl和Na2SO4胁迫试管苗根系中K+含量随盐浓度增加呈先下降后上升的趋势,且NaCl处理始终略高于Na2SO4处理;当盐浓度大于0.6%时,根系K+含量显着高于对照(P<0.05),而盐浓度为1.0%时,根系中K+含量达到最大,NaCl和Na2SO4处理较对照分别显着增加了62.5%和56.3%。相同浓度的两种盐胁迫下,试管苗叶片中K+含量明显高于根系,Na2SO4胁迫下试管苗叶片中K+含量明显高于NaCl胁迫组(P<0.05),而其根系中K+含量与NaCl胁迫组差异不显着(P>0.05)。【图略】
另外,NaCl和Na2SO4胁迫下披针叶黄华试管苗叶片和根系中Ca2+含量的变化趋势相似,即随着盐浓度的增加逐渐降低(图4,C)。其中,随盐浓度增加,披针叶黄华试管苗叶片Ca2+的含量呈现持续降低的趋势且显着低于对照 (P<0.05);而根系Ca2+的含量在盐胁迫浓度为0.4%及以下时变化不显着,在盐胁迫浓度为0.6%及以上时显着比对照下降(P<0.05)。比较NaCl和Na2SO4胁迫下试管苗叶片和根系Ca2+含量发现,Na2SO4胁迫试管苗叶片和根系Ca2+含量均高于相同浓度NaCl胁迫处理,叶片含量明显高于同浓度下根系含量。可见,披针叶黄华试管苗叶片和根系的离子含量及其对盐胁迫的响应不尽相同。
2.3.2 Na+/K+和Na+/Ca2+比值 由表1可知,随着盐胁迫浓度的增加,披针叶黄华试管苗叶片与根系中Na+/K+和Na+/Ca2+均呈逐渐升高趋势,且均显着高于对照(P<0.05)。Na+/K+和Na+/Ca2+比值的提高既与试管苗叶片和根系中Na+含量的净增加有关,也与叶片和根系中K+和Ca2+含量的降低有关。
NaCl胁迫下披针叶黄华试管苗叶片Na+/K+和Na+/Ca2+明 显 高 于 相 同 浓 度Na2SO4胁迫组,而根系Na+/K+和Na+/Ca2+则低于Na2SO4胁迫组。以上结果说明Na2SO4胁迫对试管苗离子平衡的破坏作用明显弱于NaCl胁迫,即披针叶黄华试管苗对Na2SO4胁迫的适应性明显强于NaCl胁迫。
3 讨论
3.1 NaCl和Na2SO4胁迫与试管苗有机渗透调节物质含量的关系
大多数研究者认为,脯氨酸的积累可作为一种耐盐生理指标,但也有研究认为脯氨酸的积累与耐盐性呈负相关,是胁迫对植物伤害的结果,其积累可反映渗透胁迫对植物伤害的程度。本研究中,低浓度盐胁迫下试管苗叶片脯氨酸含量变化不明显(P>0.05),随盐胁迫浓度的升高其含量显着升高(P<0.01),结合中浓度盐胁迫严重抑制了试管苗生长的事实,可推断脯氨酸的积累是一种伤害反应,可反映盐胁迫对试管苗的伤害程度。同时,由于NaCl胁迫下试管苗叶片脯氨酸增幅大于相同浓度Na2SO4胁迫处理,说明NaCl对披针叶黄华试管苗的伤害程度比Na2SO4大,这与不同浓度盐胁迫下沼 泽 小 叶 桦 (Betula microphylla)和 凤 毛 菊(Saussurea runcinata)幼苗脯氨酸含量变化结果一致。而1.0% NaCl胁迫处理叶片中游离脯氨酸含量略低于0.8% NaCl胁迫处理,可能与高盐胁迫下试管苗植株枯萎,造成细胞死亡、使线粒体的膜透性失控,游离脯氨酸进入线粒体被相关酶类分解有关。
研究表明,盐胁迫诱导植物细胞内可溶性糖含量增加,以降低细胞的渗透势,提高植物组织的持水力,可溶性蛋白含量升高也有利于提高植物对盐环境的耐受性。本试验中,随盐胁迫浓度的升高,试 管 苗 叶 片 中 可 溶 性 糖 含 量 持 续 升 高,且Na2SO4胁迫下的增幅明显大于相同浓度NaCl胁迫 下 的 增 幅;而 同 期 可 溶 性 蛋 白 含 量 增 幅 在Na2SO4浓度为0.4%及以下时并不显着,这可能与本试验材料的原生境———河西走廊的盐渍土中盐分以硫酸盐为主有关,当Na2SO4浓度为0.6%及以上时,可溶性蛋白含量显着高于对照,可能是高浓度Na2SO4胁迫诱导细胞中合成了盐适应性蛋白,对其进行渗透调节,维持了细胞的正常代谢活性。
可见,在Na2SO4浓度低于0.6%时,可溶性糖是披针叶黄华试管苗主要的渗透调节物质,而在浓度为0.6%及以上时,可溶性糖和可溶性蛋白共同作用,调节试 管 苗 的 渗 透 势。在NaCl胁 迫 浓 度 低 于0.8%时,试管苗受到可溶性糖和可溶性蛋白的共同渗透调节,而当NaCl浓度高于0.8%时,盐胁迫抑制了可溶性蛋白的合成,可溶性糖成为主要的渗透调节物质。
Na2SO4胁迫下可溶性糖和可溶性蛋白的调节能力和适应盐胁迫的调节范围均大于NaCl,而作为本试验中伤害指标的脯氨酸的积累却小于同浓度NaCl胁迫的值。
3.2 NaCl和Na2SO4胁迫与披针叶黄华试管苗离子含量的关系
盐胁迫促进Na+等有害离子大量进入植株体内,并造成积累,破坏植物体内的离子和水分平衡,对植株生长造成伤害。研究认为,K+在植物抗盐中起作用,Na+诱导组织内K+含量降低是造成盐害的原因之一。本研究中,盐胁迫使试管苗叶片和根系的Na+、K+和Ca2+含量发生了深刻变化。
Na+含量在叶片和根系中均随盐浓度增加而上升,但根系Na+增幅明显大于叶片,说明披针叶黄华利用积累在根系的Na+来维持细胞的渗透势,满足水分代谢的需要,从而减轻盐胁迫对试管苗的伤害。
比较而言,Na2SO4胁迫下试管苗叶片中Na+增幅低于同浓度NaCl胁迫下的增幅,而根系中贮存的Na+却高于同浓度NaCl胁迫下的量,这可能与Cl-毒害和SO42-保护有关。
两种盐胁迫下的K+含量在叶片中均下降,但仍维持在较高水平,这有利于正在生长的幼嫩组织中保持较高K+含量,避免营养亏缺使之耐盐。同时,NaCl胁迫下叶片K+含量降幅大于相同浓度Na2SO4胁迫下的降幅,而根系K+含量维持较高水平,尤其在高盐(≥0.6%)胁迫下增幅明显。试管苗根系通过维持高K+含量,进而保证Na+/K+比仍维持在较低水平,由于Na+和K+间的拮抗作用,根系 高K+含量抑制了Na+过多进入,使运到叶片的Na+大为减少,维持了地上部离子平衡,缓解了盐胁迫对试管苗的伤害,这与陈贵林等对白刺试管苗的研究结果相似,这可能是试管苗在高盐环境下存活的原因之一。
Ca2+有助于提高植物对K+选择性吸收的能力以及维持K+/Na+。本实验低盐(≤0.4%)胁迫下,试管苗叶片Ca2+含量随盐浓度增加迅速降低,而根系Ca2+含量变化不大 (P>0.05);高盐 (≥0.6%)胁 迫 下 根 系Ca2+含 量 迅 速 降 低,抑 制 了Ca2+向叶片的运输,导致叶片Ca2+含量进一步下降。由此可见,低浓度盐胁迫下试管苗根系维持了较高的Ca2+浓度及低的Na+/Ca2+比,使离子平衡得以维持;高浓度盐胁迫下,这种平衡被打破,导致大量有 害 离 子 进 入 植 物 体 内,造 成 盐 害。同 时,NaCl胁迫下叶片Na+/K+和Na+/Ca2+增幅均大于相同浓度Na2SO4胁迫下的增幅,表明NaCl胁迫下试管苗的Na+、K+和Ca2+运输选择机制受到破坏程度较大,导致更多的Na+运输到叶片,使光合细胞的膜结构和其它代谢过程受到伤害比Na2SO4胁迫下大,这可能是披针叶黄华试管苗在Na2SO4胁迫下 生 长 状 态 好 于 同 浓 度NaCl胁 迫 的 原 因之一。
综上所述,披针叶黄华试管苗在受到盐胁迫时通过增加有机渗透调节物质,如可溶性糖和可溶性蛋白量来降低细胞的渗透势,以及维持根系中较高的K+、Ca2+含量、抑制叶片中Na+的积累,调节Na+/K+和Na+/Ca2+处于较低水平,以此来适应盐渍生境。Na2SO4胁迫下试管苗叶片Na+含量和Na+/K+和Na+/Ca2+比低于同浓度NaCl胁迫,而可溶性糖和可溶性蛋白的含量以及根系K+、Ca2+含量却大于同浓度NaCl胁迫,从而使披针叶黄华对Na2SO4胁迫具有更强的适应性。
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