摘 要： 颅骨由于形态特殊及对脑组织具有保护作用，其发育过程一直是研究的热点。近年来的研究发现硬脑膜对于颅骨的生长具有重要作用，其不仅直接参与颅骨的发育，还可以为颅骨的发育提供必需的支持和细胞因子。本文拟对硬脑膜与颅骨生长的关系进行综述，以期为进一步发现硬脑膜的作用以及颅骨发育的相关机制提供线索。
关键词 : 硬脑膜;颅骨生长;颅骨发育机制;颅骨形成;信号通路;
颅骨具有十分独特的解剖结构，在脊椎动物的生活中起着非常重要的作用，并可为哺乳动物提供从食物的获取到听觉、嗅觉、视力和味觉等器官的各种支持。颅骨发育异常可能导致严重的面部变形，如颅骨缝隙狭窄或颅骨缝线骨化过早，不仅可引起患儿面部发育的异常，还会严重影响患儿脑的生长和发育，使其出现颅内压升高、认知障碍、智力下降、精神异常等并发症[1,2]。尤其对于胚胎期及3岁以内的幼儿来说，因硬脑膜及颅骨处在重要的分化及生长期，颅骨发育异常更易导致此种情况的发生[3]。此外，颅骨的大小和形状也直接反映了成年大脑的形态和功能[4]。近年来，越来越多的研究表明，硬脑膜在大脑和颅骨的发育过程中发挥着重要的作用[3]，尤其是未成熟的硬脑膜可通过膜内成骨分泌多种生物因子促使成骨细胞转化为骨细胞，以此调节并影响着颅骨的形成与发育[5,6]。本文拟对现有的研究进行总结，以期为进一步了解硬脑膜对颅骨生长和发育的影响提供线索。
1、 颅骨形成和发育的分子学和细胞学机制
哺乳动物颅盖由八块骨头组成，这些骨头分别来自脑神经嵴细胞和近轴中胚层细胞[7]。其中额骨祖细胞起源于脑神经嵴细胞，而顶骨祖细胞起源于近轴中胚层细胞。已有研究显示，在小鼠胚胎发育模型中可观察到在胚胎期第10.5天时，额骨和顶骨形成；胚胎期第11.5～13.5天时，早期颅盖骨祖细胞形成[3]。颅盖骨祖细胞于胚胎期第13.5天开始由基底顶端向上分化，同时在顶端以扩展的方式覆盖大脑。颅骨的发育机制是多条细胞信号转导通路共同调控的，其中骨形态发生蛋白信号通路、成纤维细胞生长因子信号通路等与颅骨发育的关系最为密切[8]。
1.1、 骨形态发生蛋白信号通路
骨形态发生蛋白是转化生长因子-β超家族的受体成员，可通过Smad1/5/8的磷酸化介导细胞内信号的传导和骨细胞的形成。在颅骨细胞分化的早期，骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4和磷酸化Smad1/5/8在SOA-间质细胞中呈现高表达的特征[9]。骨形态发生蛋白可以调节颅骨形成细胞中Msx1和Msx2基因的表达，但已有研究报道单个骨形态发生蛋白表达的缺失通常不足以导致Msx1或Msx2基因表达活性的完全丧失，这一现象也表明可能存在多个调控Msx相关基因的信号通路，进而得以保证颅骨正常发育[10]。
1.2、 成纤维细胞生长因子信号通路
成纤维细胞生长因子由22个配体和4个成纤维细胞生长因子的酪氨酸激酶受体构成，成纤维细胞生长因子信号通路对于颅骨的发育同样起着非常重要的作用。成纤维细胞生长因子受体2和途径传感器ERK1/2在SOA-间充质细胞中呈现高表达，而其主要的配体成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子10在上层表面外胚层中高表达[11]。通过选择性沉默SOA-间质细胞中成纤维细胞生长因子受体2，使细胞增殖出现异常，可导致头骨发育和形态异常。同样，成纤维细胞生长因子信号通路拮抗剂的过表达也可以导致额骨所占头骨比例的减少和颅骨形态的改变，但在其突变体中仍可观察到骨化骨的存在，这表明骨启动程序没有被完全破坏[12]。大多数成纤维细胞生长因子信号通路突变体对颅骨发育的影响虽不如骨形态发生蛋白信号通路显着，但已有研究显示成纤维细胞生长因子信号通路通常在颅骨发育不全突变体和人类颅突综合征中受到严重破坏，这表明其亦是颅骨发育的重要调控通路[13]。
1.3、 Wnt/β-catenin信号通路
Wnt/β-catenin信号通路在颅骨形成的过程中也起着十分重要的作用，该信号通路含有19个配体，并可与卷曲相关蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6结合，从而调节下游的信号通路。在颅骨早期发育期间，颅面结构的增殖和存活均需要Wnt/β-catenin信号通路进行转导。已有的研究表明β-catenin可调控细胞内信号转导通路，活化的受体可与TCF/LEF转录因子结合，从而在胚胎发育过程中以多种方式调节基因转录[14,15]。由于Wnt信号通路可直接调节相关基因和蛋白的表达，Wnt信号通路条件突变严重时可导致颅骨缺损，阻滞Wnt/β-catenin信号通路转导会导致头部和面部完全缺失[7]。已有研究表明相比于敲除Wnt基因，选择性地抑制单个Wnt配体基因的表达会对颅骨分化产生轻微的影响，但不会引起颅骨发育缺失或明显异常，提示不同配体之间可能存在功能冗余[16]。在胚胎发育早期，抑制表面外胚层中Wnt配体所需的专用转运蛋白的分泌可导致SOA-间质细胞中经典Wnt/β-catenin转导信号通路的丢失[17]。与其他信号通路突变体不同，SOA-间质细胞和面部间充质干细胞中的β-catenin缺失会造成关键软骨形成决定簇Sox9的异位表达，从而导致颅骨和非成骨性间充质转化为软骨[18]。
1.4、 表观遗传学的调控
表观遗传也参与颅骨发育的调节，其中多梳抑制复合物2对于颅骨细胞发育的影响最为显着。多梳抑制复合物2由4个不同的蛋白质亚基组成，分别为zest同源物增强子2、SUZ12、EED和RbAp46/48（也叫作RBBP4/7），其中zest同源物增强子2基因是该复合物的催化成分，负责在组蛋白中的第27个赖氨酸上建立甲基化修饰反应，进而影响颅骨的形成[19]。因此，与其他表观遗传调控因子的小鼠突变体相比，zest同源物增强子2功能丧失的突变体表现出严重的颅盖骨形态改变或者缺失。小鼠模型中，zest同源物增强子2的缺失可能导致多个颅骨部分或完全丧失，使zest同源物增强子2基因沉默，可以在胚胎期第9.5天观察到H3K27me3水平明显降低，进而在胚胎期第16.5天观察到额骨完全消失[20]。相反，在胚胎期第9.5天对胚胎进行修复后，zest同源物增强子2基因的丢失不会导致H3K27me3水平下降，在不同条件下的zest同源物增强子2突变体造成的表型存在显着差异，其具体机制尚不清楚，分析其可能的原因为胚胎发育早期在颅骨祖细胞中稳定的H3K27me3水平在zest同源物增强子2基因缺失后仍可保持在特定位点，或者在诱导颅盖骨启动转录程序之前需要zest同源物增强子2基因的功能，而在启动转录程序后zest同源物增强子2基因功能的丧失不会导致H3K27me3水平的下降[11]。
2、 硬脑膜与颅骨发育
由于颅盖骨和硬脑膜紧密并列形成，因此，在发育过程中两个结构之间将存在广泛的调节与相互作用[4]。硬脑膜和覆盖的颅骨之间的密切关系已经被证明，出生后未成熟的硬脑膜提供的成骨生长因子、成骨细胞因子和细胞外基质分子等对颅骨的骨化和形态发育至关重要[21]。已有研究显示在切除或移植处于胎儿或新生儿阶段受试动物的硬脑膜后发现，硬脑膜是重新骨化的充分必要条件，这也表明硬脑膜是成骨细胞的重要信号来源[22]。此外，硬脑膜可以分泌多种因子，包括转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白超家族成员在内的多种细胞因子，且这些因子均可介导颅骨的形成与发育，因而硬脑膜对发育期的颅骨生长与发育具有十分重要的作用。
2.1、 硬脑膜直接参与颅骨的发育
膜内成骨在骨折愈合、关节置换和牙种植体手术、牵引成骨、应力性骨折愈合、创伤或肿瘤切除引起的骨缺损修复等临床应用中发挥着重要作用[5]。扁骨包括颅骨穹窿和锁骨，均由膜内骨化形成，神经嵴来源的细胞（额骨、鼻骨、上颌骨、下颌骨）和旁轴中胚层来源的细胞（顶骨、枕骨）结合形成颅骨[7]。JIANG等[7]的研究展示了WNT1-Cre/R26R转基因胚胎从胚胎期第9.5天到17.5天的一系列发育阶段，通过对大鼠胚胎整体切片可见，在胚胎期第13.5天时，位于脑膜表面的浓缩真皮间充质可以被识别为骨骼基膜，最终凝聚的真皮层形成颅顶的真皮骨，也就是早期颅骨的最初形态。诸多研究结果也验证了这一观点，在人类妊娠期的第6周和小鼠胚胎期第13天，硬脑膜限制层出现在大脑的基底外侧，随后，硬脑膜分化向顶点发展，小鼠颅骨的额骨和顶骨也来自其大脑基底外侧的眶上间充质（位于眼眶上方），并在颅顶进行扩张成型，在扩张过程中，颅骨的生长与硬脑膜限制层的范围密切相关，这一观察结果揭示了新生硬脑膜引导颅盖骨生长的过程[23]。由此可见，早期颅骨的形成与发育是由硬脑膜直接参与并调控的。
2.2、 硬脑膜参与颅骨发育的相关机制
由于转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白超家族成员的多种细胞因子不能直接由颅盖骨祖细胞合成，因此，硬脑膜中合成和分泌的上述细胞因子对于颅骨的形成具有十分重要的作用。已有研究报道Foxc1突变小鼠具有严重的脑膜缺陷，其中蛛网膜和硬脑膜未能在大脑的顶侧形成，携带上述突变体的受试动物出生时通常表现为顶侧缺少颅骨，分析可能的原因为这些携带突变体的受试动物在眶上间充质开始成骨后不久，颅骨的发育就被抑制，在胚胎发育的中晚期颅骨生长过程中的细胞增殖和根尖生长减少[24]。在正常发育过程中，Foxc1基因并不在颅骨中表达，而是在颅骨下方的硬脑膜中高表达，Foxc1可通过硬脑膜和颅骨之间的相互作用间接调节颅骨的早期生长。
与Foxc1突变体相似，脑神经C细胞特异性Tgfbr2突变体具有严重的脑膜缺损，并伴有颅脑缺损，在这些突变体中，额骨和顶骨均不能发育，而在正常发育过程中，顶骨与覆盖大脑半球的硬脑膜相接触，因此脑神经C细胞特异性Tgfbr2突变体顶骨缺损归因于潜在的硬脑膜丢失，这意味着硬脑膜对于顶骨发育至关重要[25]。
2.3、 硬脑膜为颅脑发育提供力学支持
硬脑膜除了参与细胞因子的分泌外，还可以为颅骨的发育提供物理学支持。在儿童生长期颅骨骨折的患儿中，多数患儿继发于硬脑膜外伤，进一步的研究表明，由于婴幼儿颅脑发育较快，大脑的发育以及颅内压共同导致颅骨一直处于向外的扩张张力作用中，不利于颅骨的发育与成型[26]。硬脑膜虽然总体硬度较骨骼低，但其具有较好的顺应性，并有助于缓解大脑发育产生的张力，从而为颅骨的发育和形成提供力学支持。因此，对于硬脑膜外伤的患者，在修补硬脑膜的同时，使用颅骨钛网等材料进行固定可以获得良好的疗效，并有助于缓解外伤引起的颅骨缺损和减少生长性骨折等不良反应的发生[27,28,29,30]。
3 、总结与展望
颅骨发育是一个十分复杂的过程，且其发育的具体分子机制尚不明确，硬脑膜对于颅骨的发育和维持其正常形态均具有重要作用。硬脑膜不仅直接参与颅骨的形成，为颅骨形成提供所需的细胞因子，还可以为颅骨的形成提供力学支持。在今后的研究中，尚需进一步探索颅骨发育对硬脑膜生理功能的影响及相关机制，深入研究颅骨发育与硬脑膜的相互作用将为说明颅骨特殊的解剖结构以及几何形态的形成提供新的线索。
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