Ghrelin 是生长激素促分泌素受体( growth hor-mone secretagogue receptor，GHS-R) 的内源性配体，主要由胃黏膜组织中的泌酸细胞分泌。Ghrelin 的生物学作用十分广泛，可促进生长激素分泌; 调节摄食和能量代谢; 刺激胃动力和胃酸分泌; 调节心血管功能等。新近研究发现，ghrelin 与消化道运动关系密切，外周和中枢给予 ghrelin 可加速胃排空，改善术后肠梗阻，促进胃和十二指肠消化间期复合肌电活动。Gong 等用蛋白印迹方法和聚合酶链反应( polymerase chain reaction，PCR) 技术发现 GHS-R在大鼠的下丘脑有表达; Gnanapavan 等用 PCR 技术证实，ghrelin 和 GHS-R 在人的胃、小肠、结肠、胰腺、胆囊、肺脏、垂体、卵巢、血管等处均有表达;Dass和 Xu 等利用荧光免疫组织化学方法在人、大鼠和豚鼠的胃和结肠也发现了 ghrelin 及其受体。然而，关于 ghrelin 和 GHS-R 在中枢的组织细胞学分布及表达量的比较尚未见报道。此外，由于新鲜脑组织比较难以判定各核团的精确界线，PCR及蛋白印迹技术只能分离出大鼠的部分脑区( 如海马和下丘脑) ，不能分离出其中包括的微小核团和亚核团，并进行表达量比较。因此，作者采用免疫组织化学和图像分析方法观察大鼠中枢 ghrelin 和GHS-R 的分布，重点分析比较二者在与消化功能相关脑区的表达，为阐明中枢给予 ghrelin 的促胃肠动力作用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 实验动物 健康纯种 Sprague-Dawley 大鼠 8只，雌雄不拘，体质量 220 ～240 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1． 2 主要试剂与仪器 兔抗人 GHS-R 抗体购自美国 Santa Cruz 公司，兔抗鼠 ghrelin 抗体购自美国凤凰生物制品有限公司，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物( strept-avidin-biotin complex，SABC) 羊抗兔免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德公司，二氨基联苯胺( diaminobenzidine，DAB) 显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，Q550CW 型图像采集与分析系统购自德国 Leica 公司。
1． 3 取材与标本制备 实验大鼠用含 100 g·L－ 1的水合氯醛400 mg·kg－ 1腹腔注射麻醉，经左心室穿刺至主动脉，用生理盐水快速冲血管，含 40 g·L－ 1的多聚甲醛缓冲液经升主动脉灌注。取出大脑和小脑，切成厚4 mm 小块，40 g·L－ 1的多聚甲醛缓冲液固定8 h，用含质量分数 20% ～ 30% 的蔗糖溶液梯度脱水，液氮速冻后，组织包埋剂包埋，恒冷冰冻切片机切片。脑片行连续切片，厚15 μm。
1． 4 免疫组织化学染色 用 SABC 法进行 ghrelin和 GHS-R 的免疫组织化学染色。具体步骤如下: 冷冻切片用磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline，PBS) 浸泡 5 min，加入柠檬酸缓冲液( pH 6． 0) ，微波修复，晾至室温，PBS 冲洗3 次，每次 5 min; 体积分数3% 的过氧化氢溶液( hydrogen peroxide，H2O2) 浸泡30 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min; 体积分数 0． 5% 的聚乙二醇辛基苯基醚( triton X-100) 浸泡 20 min，PBS冲洗3 次，每次5 min。体积分数 10%正常山羊血清封闭( 37 ℃，30 min) ，甩去多余液体，切片分别滴加兔抗鼠 ghrelin 抗体( 1: 2 500) 和兔抗人 GHS-R 抗体( 1:100) ，4 ℃过夜，PBS 冲洗3 次，每次5 min，滴加羊抗兔抗体( 37 ℃，40 min) ，PBS 冲 洗 3 次，每 次10 min，滴加生物素化的辣根过氧化物酶复合物( avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex，ABC) ( 37 ℃ ，20 min) 。PBS 冲洗 3 次，每次 10 min，DAB 显色，中性树胶封片，用图像分析系统观察 ghre-lin 和 GHS-R 阳性表达。用 PBS 代替一抗做阴性对照，其余步骤不变。
本实验选取与消化功能相关的核团进行重点观察，并分析了 ghrelin 和 GHS-R 阳性反应细胞在各核团不同分区的表达。中枢阳性细胞计数: 每只大鼠计数 5 张切片，每张切片在阳性细胞最密集处随机选取 5 个视野计数，取平均值作为该切片的阳性细胞数。对每只大鼠同一脑区的 ghrelin 和 GHS-R阳性细胞记数时必须选择在相同平面。
1． 5 统计学处理 应用 SPSS 13． 0 统计软件进行数据分析，免疫反应阳性细胞数以均数 ± 标准差( x珋 ± s) 表示，多组间比较采用方差分析，P ＜0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 Ghrelin 与 GHS-R 免疫阳性细胞的染色特征在大鼠中枢神经系统，ghrelin 与 GHS-R 免疫阳性细胞广泛分布于多个脑区，二者的阳性表达类似，阳性细胞为细胞膜和( 或) 细胞质有棕黄色颗粒沉着，细胞核无棕黄色颗粒沉着。二者的免疫强阳性反应在大脑皮质、下丘脑、丘脑室周核、海马( hippocamp，HIP) 、杏仁核、小脑及脑干等部位均可见 ( 图 1、图 2) 。【图1-2略】
2． 2 Ghrelin 和 GHS-R 免疫阳性细胞在与消化道功能相关脑区的表达 在下丘脑区室旁核( periven-tricular nucleus，PVN ) 、弓 状 核 ( arcuate nucleus，ARC) 、视前核( preoptic nucleus，PON) 、视上核( su-praoptic nucleus，SON) 、下丘脑外侧区( lateral hypo-thalamic area，LH) 、下丘脑腹内侧核 ( ventromedialhypothalamic nucleus，VMH) 、下丘脑背内侧核( dor-somedial hypothalamic nucleus，DMH) 、下丘脑背侧核( dorsal hypothalamic nucleus，DO) 等处均可见 ghre-lin 及 GHS-R 阳性反应细胞。阳性细胞的细胞膜为棕黄色颗粒沉着，细胞核无棕黄色颗粒沉着。其中，ghrelin 在 PVN 和 LH 阳性反应最强，免疫反应阳性细胞数分别为116． 31 ±7． 76 和107． 02 ±8． 80，明显高于 ARC( 75． 12 ± 5． 59) 、DMH( 56． 84 ± 7． 07) 和VMH( 62． 54 ± 6． 93 ) ，差异有统计学意义 ( P ＜0. 05) ( 图 1、图 3) ; GHS-R 在 PVN 和 ARC 阳性反应强，免疫反应阳性细胞数分别为 111． 06 ± 11． 80 和97． 06 ± 10． 37，明显高于 LH( 74． 70 ± 6． 04) 、DMH( 58． 65 ±7． 28) 和 VMH( 48． 24 ± 6． 58) ，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; 阳性细胞染色深，数目多，细胞体呈圆形或椭圆形，多数细胞有粗短突起。其余核团阳性细胞数目较少，分布稀疏，染色呈淡黄色( 图 2、图 3) 。【图3】
Ghrelin 和 GHS-R 在 HIP 的 CA1、CA2、CA3、CA4 区的颗粒层均有分布，细胞多数呈椭圆形，细胞膜呈深棕色，细胞体较小，分布密集。其中，ghrelin在 CA3 区阳性反应最强，免疫反应阳性细胞数为123． 20 ± 11． 17，明显高于 CA1( 67． 46 ± 6． 93) 、CA2( 37． 91 ±5． 21) 、CA4( 59． 96 ±6． 73) 区，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ( 图 1、图 4) ; GHS-R 在 CA3 和CA4 区均有强阳性反应，免疫反应阳性细胞数分别为 103． 79 ± 9． 23 和 86． 48 ± 7． 25，明显高于 CA1( 51． 16 ±6． 56) 、CA2( 43． 39 ±5． 11) 区，差异有统计学意义( P ＜0． 05) 。锥体细胞层可见二者的强阳性反应( 图 2、图 4) ，细胞膜着深棕色，细胞体较大，呈圆形、椭圆形或锥形，突起粗短，着色明显，细胞质淡染。二者在分子层均未见着色。【图4】
在杏仁核区，ghrelin 和 GHS-R 阳性细胞细胞膜和( 或) 细胞质为棕色颗粒沉着，细胞核不着色。二者均在杏仁内侧核( medial amygdaloid nucleus，Me)呈强 阳 性 反 应，免 疫 反 应 阳 性 细 胞 数 分 别 为140． 22 ± 9． 07 和 115． 66 ± 7． 35，明显高于杏仁基底内侧核 ( basomedial nucleus of the amygdale，BM)( 67． 84 ±7． 36) 、杏仁基底外侧核前部( anterior divi-sion of the basolateral nucleus of the amygdale，BLA)( 33． 46 ±4． 24) 、杏仁基底外侧核后部( posterior di-vision of the basolateral nucleus of the amygdale，BLP)( 43． 06 ±6． 24) 、杏仁中央核( central amygdaloid nu-cleus，CeA) ( 22． 58 ± 3． 60) 、杏仁外侧核( lateral a-mygdaloid nucleus，LA) ( 31． 95 ± 5． 77) ，差异有统计学意义( P ＜0． 05) ( 图 1、图 2、图 5) ，细胞体多数呈椭圆形，细胞膜为深棕色，许多细胞有短粗突起。
Ghrelin 在 BLA 与 BLP 也有较多阳性细胞，细胞体较大，有短粗突起，形态以圆形居多，细胞膜染色呈淡棕色。GHS-R 在 BM 有较多阳性细胞，细胞体较小，呈圆形或椭圆形，染色呈棕黄色。在 CeA 和LA，二者的阳性细胞数目较少，细胞体较小，染色呈淡黄色。
2． 3 Ghrelin 和 GHS-R 免疫阳性细胞在中枢其他部位的表达 在大脑皮层区，各层均有 ghrelin 与GHS-R 阳性反应细胞。二者在分子层、外颗粒层、多形细胞层阳性反应均较弱，染色呈淡黄色，阳性细胞轮廓不清晰，体积较小，形态以圆形和椭圆形居多，还可见梭形细胞。在内颗粒层和外锥体细胞层，ghrelin阳性反应较强，阳性细胞呈棕黄色，轮廓清晰，形态呈圆形或椭圆形，无突起染色，细胞核不着色。GHS-R阳性表达在外锥体细胞层较多，内颗粒层较弱。在内锥体细胞层，GHS-R 和ghrelin 阳性反应均较强( 图1、图2) ，细胞呈棕黄色，突起染色明显，细胞核不着色，形态多为锥形。【图5】
在小脑蒲肯野细胞，ghrelin 与 GHS-R 均呈强阳性反应( 图 1、图 2) ，细胞胞体大，呈梨形，细胞膜和细胞质着深棕色，突起无明显着色。二者阳性反应在小脑的分子层和颗粒层较弱，细胞小而圆，细胞膜和细胞质呈棕黄色。此外，在前庭神经上核、外侧核、中缝核、小细胞网状核和面神经核等处均可见ghrelin 和 GHS-R 阳性细胞。
在延髓，ghrelin 与 GHS-R 均有强阳性反应( 图 1、图 2) ，细胞膜和细胞质呈深棕色，细胞体呈多形性，有明显突起。在孤束核、迷走神经背核、延髓网状核及最后区等处也可见 ghrelin 和 GHS-R 阳性细胞。
3 讨论
新近研究发现，ghrelin 与消化道运动关系密切，可促进摄食和胃排空，增加胃酸分泌，加速小肠转运，有效改善术后肠梗阻。近来的研究多关注于ghrelin 的组织分布，已有研究发现，ghrelin 在胃肠道和中枢神经系统均有分布，主要由胃黏膜内分泌细胞( 主要为 X/A 样细胞) 分泌，在小肠、肾脏、下丘脑、腺垂体、胰腺、甲状腺、心脏、卵巢及胎盘等处也有少量分泌，可通过内分泌或旁分泌形式作用于受体，在局部发挥作用。但对其受体 GHS-R 分布的研究并不充分。以往研究发现，GHS-R 主要分布于垂体、下丘脑和胃，在心脏、肺、胰腺、肠、脂肪组织及肾也有分布，参与调节内分泌与能量代谢。目前，关于二者在中枢各脑区的组织学定位及微小核团和亚核团的表达水平比较尚未见报道。作者就此进行了进一步研究，并重点分析了二者在与消化功能密切相关脑区的表达水平比较。
研究结果显示，GHS-R 在大鼠中枢广泛存在，阳性细胞细胞核不着色，细胞膜着黄色或棕黄色，细胞质有少量着色，主要分布于大脑皮质、下丘脑、丘脑室周核、HIP、杏仁核、小脑及脑干等部位。以往研究用蛋白印迹法和 PCR 技术证实 GHS-R 在中枢和外周均有表达，用荧光免疫组织化学方法在人、大鼠和豚鼠的胃和结肠肠神经丛也发现 ghrelin 及GHS-R。本研究结果与其结果相符，并在此基础上进一步观察了二者在与消化功能密切相关脑区( 包括核团及亚核团) 的表达。
下丘脑位于间脑的腹侧部，构成第 3 脑室下部的底壁和侧壁。除参与神经内分泌、水电解质代谢和体温调节等功能的调整，下丘脑也是调节摄食和消化道运动的重要中枢。下丘脑从前向后分为 3 个区: 视上部位于视交叉上方，由 SON 和 PVN组成; 结节部位于漏斗的后方; 乳头部位于乳头体。
下丘脑与其他脑区有复杂而广泛的纤维联系，它不仅接受来自大脑皮质、边缘系统、脑干的传入纤维，还发出大量的纤维到达大脑皮质、边缘系统、中脑、脑桥和延髓。下丘脑能通过 3 种途径对机体进行调节: ( 1) 由下丘脑核发出的下行传导束到达脑干和脊髓的植物性神经中枢，再通过植物性神经调节内脏活动; ( 2) 下丘脑的 SON 和 PVN 发出的纤维构成下丘脑-垂体束到达神经垂体，两核分泌的加压素( 抗利尿激素) 和催产素沿此束流到神经垂体内贮存，在神经调节下释放入血液循环; ( 3) 下丘脑可分泌多种多肽类神经激素对腺垂体的分泌起特异性刺激作用或抑制作用，称为释放激素或抑制释放激素。
近来研究发现，ghrelin 的促胃肠动力作用与下丘脑密切相关，下丘脑 ARC 可参与调节其促动力作用。以往研究证实，大鼠脑内存在 ghrelin 和GHS-R，主要分布于下丘脑，但并未研究其在下丘脑主要亚核团的表达。本研究结果显示，ghrelin和 GHS-R 免疫阳性细胞在下丘脑 PVN、ARC、LH、VMH、DMH 等处均有分布。Ghrelin 免疫阳性细胞在 LH 和 PVN 居多，GHS-R 免疫阳性细胞在 PVN 和ARC 居多。这提示在消化道运动的调节中，下丘脑发挥着重要作用，ghrelin 可能通过 PVN、ARC 及 LH发挥其生理学作用。
HIP 不仅与认知功能如学习、情感、记忆有关，也是调节内脏活动的重要中枢，它与下丘脑、杏仁核、延髓髓质有着极其复杂的相互联系，在调节哺乳动物的进食行为、饱感及胃肠运动中发挥着重要作用。HIP 结构由 HIP 本部、齿状回、下托、束状回和灰被组成。它从室间孔处延至侧脑室下脚顶部，全形呈弓形。依据 HIP 本部的细胞构筑可再将其划分为 4 个亚区，分别命名为 CA1、CA2、CA3 及 CA4区，CA4 区与下托相连接。齿状回的皮质分为分子层、颗粒层和多形层。本实验研究结果显示，GHS-R免疫阳性细胞在 HIP 各区均有分布。HIP 在解剖结构上属于边缘前脑皮质结构，边缘系统不是一个独立的解剖学和功能性实体，它是管理学习经验、整合新近与既往经验，同时启动和调节种种行为和情感反应的复杂神经环路中重要的一部分。新近研究发现，ghrelin 可通过 HIP 发挥促进胃动力作用。作者研究发现，ghrelin 免疫阳性细胞在 HIP 的 CA3 区表达最多，GHS-R 免疫阳性细胞在 CA3、CA4 区均有广泛表达。因此，有理由推测在 ghrelin 及其受体的生理作用中，HIP 可能发挥重要作用。
杏仁核是边缘系统中重要的皮层下核团，位于颞叶前部、侧脑室下角尖端上方，由多个解剖和功能不同的核团组成，主要分为皮质内侧核群与基底外侧核群，以及前杏仁区、皮质移行区 2 个大过渡区。从进化来看，皮层内侧核群比较古老，基底外侧核群较新。
杏仁核与脑干、丘脑、下丘脑及皮层感觉区等存在广泛的纤维联系，从而涉及机体许多重要生理功能的调节机制，参与情绪反应、学习记忆、生殖行为等复杂行为的整合，对摄食行为和胃肠运动的调节有重要作用。新近研究证实，杏仁核内微量注射 ghrelin可显著改善大鼠食欲，促进摄食。本研究实验结果表明，ghrelin 和 GHS-R 免疫阳性细胞在杏仁核各亚核团均有表达，以 Me 最多，CeA 最少; 杏仁基底外侧核也有较多 ghrelin 免疫阳性细胞。因此，提示 Me和杏仁基底外侧核很可能是 ghrelin 调控胃肠运动的重要中枢部位之一。
综上所述，ghrelin 及其受体 GHS-R 在中枢各脑区广泛存在，主要位于大脑皮质、下丘脑、HIP、杏仁核等部位。Ghrelin 可能作为神经调节递质广泛作用于中枢各脑区，发挥各种生理调节作用。在与消化功能密切相关的脑区，二者表达量较多，在 HIP、杏仁核及下丘脑均有强阳性表达。这提示 ghrelin可能通过 GHS-R 在这些相关脑区参与调节消化道运动。
