探讨骨骼肌蛋白消耗的机制和可能的调控因子

　　骨骼肌是人体最大的含氮组织，是烧伤脓毒症时机体蛋白质丧失的主要来源。泛素 - 蛋白酶体途径在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白的降解中起到一定作用，但其不能降解肌动球蛋白复合体（骨骼肌大分子原件）和肌原纤维，说明还有其他蛋白酶在泛素- 蛋白酶体途径之前起作用。

　　本研究采用体外培养骨骼肌细胞，测定凋亡效应相关蛋白酶 cys 蛋白酶－3（caspase-3）对骨骼肌细胞蛋白降解率的影响，探讨骨骼肌蛋白消耗的机制和可能的调控因子，为临床干预或调控骨骼肌萎缩和肌肉蛋白高消耗提供新的依据。

　　1、 材料和方法

　　1.1 材料与试剂 ：肌动球蛋白复合体（Sigma-Aldrich 公司），Caspase-3 （默克公司），Ac-DEVD-CHO（Caspase-3 的小分子四肽抑制剂，默克公司），低糖 DMEM，特级胎牛血清，马血清，青霉素，乳鼠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 骨骼肌细胞的分离纯化与培养：取胎龄 2天的 Wistar 乳鼠，断颈法处死，无菌条件下获取四肢肌肉组织，将其存放于培养瓶中，37℃细胞培养孵箱内倒置放置 3h 后，翻转培养瓶，含 10%胎牛血清的 DMEM 覆盖组织小块，维持 3～6h；在培养瓶中加入 0.125%胰蛋白酶等量，37℃细胞培养孵箱内进行消化，随时吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，如组织块已经变白、稀疏，或者发现组织已分散成细胞团或单个细胞，立即加入含 10%胎牛血清的DMEM 终止消化。150 目不锈钢细胞筛过滤，去除大的未消化完全的组织块，过滤液 800～1000rpm 低速离心 10min，去除上清，加入含血清培养基，轻轻吹打使成细胞悬液，计数后按一定的比例接种于25ml 培养瓶中培养。将生长于盖玻片上的细胞进行MHC（肌球蛋白重链）免疫组化染色行骨骼肌细胞的鉴定后，将培养的骨骼肌细胞用 0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 复合消化传代。

　　1.2.2 刺激骨骼肌细胞融合为肌管：采用含 10%胎牛血清的培养基主要保证骨骼肌细胞的生长，骨骼肌细胞不能反映骨骼肌组织的生理状态。必须将骨骼肌细胞融合为肌管后再进行研究。本研究采用含2%马血清的 DMEM 培养刺激骨骼肌细胞融合为肌管。镜下可见骨骼肌细胞收缩。

　　1.2.3 caspase-3 体外对肌动球蛋白复合体的作用：反应采用 20μl 体系，在反应缓冲液中分别加入0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg 的肌动球蛋白复合体，然后加入 1 单位的重组 Caspase-3，混合物在 37℃孵育 3h，加入 50nM Ac-DEVD-CHO 中止反应，按照Western Blot 步骤，混合物置于 SDS-PAGE 电泳，抗actin 抗体（作用于 14kDa-actin）杂交，分辨率 400的乐凯胶卷拍照。

　　1.2.4 Caspase-3 与骨骼肌蛋白降解间的关系：将离体培养的骨骼肌细胞分为 3 组，第一组为正常对照，第二组加入 1 单位 Caspase-3，第三组加入 50nM Ac-DEVD-CHO，体系中均加入 2mM ATP(三磷酸腺苷)，37℃恒温孵育 3h，10%SDS 变性液中止反应。

　　然后在培养瓶中加入细胞裂解缓冲液，振荡器混匀，1 600g 离心去除细胞核以及细胞残渣，测定加入不同物质后对骨骼肌细胞蛋白降解率的影响，骨骼肌细胞的蛋白降解率通过测定反映骨骼肌总蛋白降解率的酪氨酸和肌纤维蛋白降解率的 3- 甲基组氨酸的浓度，用氨基酸全谱分析仪测定反应终产物中酪氨酸和 3- 甲基组氨酸的含量。

　　1.3 统计学处理：所有数据均以 x±s 表示，统计学处理采用 SPSS12.0 软件进行 t 检验、方差分析，P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异非常显著。

　　2、 结果

　　首先进行肌动球蛋白复合体电泳，结果可见所获得的条带非常均一（图 1）。在 20μl 体系中分别加入 0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg 的肌动球蛋白复合体和 1 单 位 的 重 组 Caspase-3， 均 可 见 到14kDa-actin 条带，而肌动球蛋白复合体在 0.5μg、1μg 剂量时条带消失，在 2μg、4μg、8μg 时条带逐渐增大（图 2）。

　　研究结果可见，在正常骨骼肌细胞中，总蛋白降解率为 907 nmol/gPro/h，给予 caspase-3 后总蛋白降解率为 1242 nmol/gPro/h，增加 36.9%，给予 DEVD 后总蛋白降解率为 747nmol/gPro/h，下降17.7%(图 3)；对于肌纤维蛋白降解率，正常对照组为 3.147 nmol/gPro/h，给予 caspase-3 后肌纤维蛋白降解率为 5.238 nmol/gPro/h，增加 66.4%，给予 DEVD 后总蛋白降解率为 2.276nmol/gPro/h，下降 27.7%（图 4）。

　　3、 讨论

　　凋亡是生物界较为常见的一种细胞自杀行为，在凋亡过程中主要由 caspases 家族即半胱氨酸依赖－天门冬氨酸识别的蛋白酶实施细胞形态学的变化及生化改变。其中 Caspase3 是执行凋亡的主要酶，存在于细胞浆和细胞核。它在组织中广泛分布，在淋巴细胞发育中高度表达，参与免疫系统的调节。国外研究人员发现，抑制 caspase-3 活性，则肌管、肌肉特异性蛋白和肌肉纤维的形成明显减少，并提出 caspase-3 介导的信号系统参与肌肉的发生。既往研究表明，脓毒症条件下，可以同时发生严重的炎症反应和免疫细胞的凋亡，但有关烧伤脓毒症时骨骼肌细胞和凋亡之间的关系目前尚未见报道。

　　本研究结果显示，caspase 系统在骨骼肌蛋白降解中具有重要作用。为了判断 caspase 3 是否可以降解复合体，实验中将可溶性肌动球蛋白复合体与 caspase 共同孵育。孵育前将肌动球蛋白复合体置于非变性 SDS-PAGE 电泳，结果见到单一的蛋白条带，表明所获取的肌动球蛋白复合体纯度较高。与 caspase 3 在 37℃共同孵育后，采用特异作用于14kDa 的 actin 抗体，发现 14kDa 的片段。表明caspase 3 在体外可以降解肌动球蛋白复合体，并且特征性 14kDa 的 actin 片断存在反应产物中。

　　为了进一步证明 caspase 3 在骨骼肌蛋白降解中的作用，实验在离体培养的骨骼肌细胞中分别加入 caspase 3 及其抑制剂 DEVD。结果发现加入caspase 3 后，骨骼肌总蛋白降解率增加了 36%，肌纤维蛋白降解率增加了 66%，而给予 caspase 3 抑制剂 DEVD 后则抑制蛋白降解，骨骼肌总蛋白降解率降低了 18%，肌纤维蛋白降解率降低了 29%。该研究结果表明，caspase 3 不仅可以体外降解肌动球蛋白复合体，而且还能改变骨骼肌蛋白降解率。

　　本研究表明，caspase-3 在骨骼肌蛋白降解中发挥了重要作用，参与了骨骼肌细胞的凋亡。