金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ Staphylococcus aureus,S. aureus） 是一种寄居于人体皮肤和黏膜的革兰氏阳性（ G+） 菌，是社区和院内感染的主要病原体之一[1],除引发皮肤和软组织感染[2],还可引发威胁生命的肺炎、骨髓炎、脑膜炎、心内膜炎和脓毒血症等[3].近年来由于抗生素滥用导致细菌耐药程度日趋严重，尤其是耐甲氧西林和耐万古霉素的超级菌株的出现，给临床治疗带来极大困难。2013 年中国 CHINET 细菌耐药性监测结果显示金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药株的平均检出率高达 45. 2%[4].
面对上述严峻形势，针对金葡菌的疫苗和免疫学治疗研究受到关注。然而目前尚无有效疫苗可预防金葡菌感染[5-7],主要原因之一是金葡菌致病因子众多，不同致病因子在感染不同阶段表达并发挥不同作用[8].因此寻找稳定表达于细菌表面的分子，以此作为构建联合疫苗的靶点成为现阶段研究方向[9].
脂磷壁酸 LTA（ Lipoteichoic acid） 是金葡菌上一保守性结构。由磷酸二酯键连接的磷酸甘油残基与1 个膜载体共价连接的线性聚合物[10].LTA 是 G+菌保守结构，无种属特异性，LTA 不仅表达于金葡菌表面，还广泛存在于链球菌、粪球菌等革兰氏阳性菌细胞壁表面。LTA 除维持细菌细胞壁完整结构外[11,12],还是细菌表面重要黏附分子，参与细菌对宿主细胞的黏附作用[7],诱发中性粒细胞及巨噬细胞产生活性氧、NO、酸性水解酶和防御素等[13].研究表明 LTA 在固有免疫应答中发挥起着重要作用[14-16].他们可被 TLR2 识别，并能与 CD14 分子结合，从而活化单核细胞释放大量促炎症介质，介导感染性休克和多器官功能衰竭[17],然而 LTA 为非胸腺依赖性抗原（ TI 抗原） ,免疫原性弱，难以引起有效的再次抗体应答和细胞免疫应答。在本研究中以液相法筛选噬菌体肽库，获得模拟 LTA 表位阳性序列，为后续构建针对金葡菌保守结构 LTA 的肽类疫苗候选提供实验数据。
1 材料与方法
1. 1 材料 噬菌体随机 12 肽库（ Ph. D. -12TMPhagedisplay peptide library kit） ,1 ×1013pfu / ml,购自 NewEngland Biolabs 公司，受体菌为大肠杆菌 E coliER2738.蛋白 G 珠 （ protein G beads ） 购自 SantaCruz,辣根过氧化物酶标记的抗 M13 抗体（ HRP-抗M13 抗体） 购自 GE Heathcare 公司，金黄色葡萄球菌脂磷壁酸 LTA（ Lipoteichoic acid ） 购自 Sigma 公司，抗 LTA 单抗购自 pierce 公司，HRP-链酶亲和素Streptavidin 购自 Jackson ImmunoResearch,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （ IPTG） 、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（ X-gal） 购自北京鼎国生物技术有限公司和广州斯佳生物技术有限公司，吐温-20 （ Tween-20） 、聚乙二醇 8000 （ PEG-8000） 购自南方医科大学试剂中心。
1. 2 方法
1. 2. 1 噬菌体肽库筛选 采用液相筛选法。具体操作步骤如下： 蛋白 G 珠与 TBS（ 含 0. 1%Tween） 轻柔悬匀，低速离心后去上清，以 5 mg/ml BSA 于 4℃封闭 60 min.5 μl 噬菌体线性 12 肽库、50 μl 100μg/ml 抗 LTA 单抗及 145 μl 0. 1% TBST 混匀室温孵育 20 min.蛋白 G 珠封闭后，以 0. 1% TBST 洗涤4 次，将噬菌体与抗体混合物转入已洗涤的蛋白 G珠中，轻柔混匀，室温继续孵育 15 min.0. 1% TBST洗涤 10 次，去上清加入含 1 mg/ml BSA 的0. 2 mol/L Gly-HCl（ pH2. 2） 洗脱液，室温孵育 10 min 后低速离心，留取上清立即加入 150 μl 1 mol/L Tris-HCl（ pH9. 1） 进 行 中 和。将 第 一 轮 洗 脱 产 物 侵 染ER2738、测滴度、扩增纯化后，用于下一轮筛选。第2、3 轮筛选除将洗液改为 0. 5% TBST 以外，其余步骤同第一轮筛选。完成 3 轮筛选后，测定噬菌体滴度并随机挑取蓝色噬斑制备噬菌体原种用于鉴定。
1. 2. 2 噬菌体克隆鉴定 以 pH9. 6 碳酸盐缓冲液稀释抗 LTA 单抗至5 μg/ml,50 μl/孔，4℃过夜包被酶标板，0. 25% 酪蛋白 37℃封闭 2 h,0. 5%PBST 洗板 3 次后加入 50 μl 噬菌体原种上清或 10 倍系列稀释阳性噬菌体克隆 No. 2,37℃ 孵 育 40 min.0. 5% PBST 洗板 10 次，加入 HRP-抗 M13 单抗（ 应用时 1 ∶3 000 稀释） ,37℃孵育 40 min,TMB 室温避光显色，2 mol/L 硫酸终止。以 OD450nm 值高于阴性对照 3 倍以上作为阳性噬菌体克隆。
1. 2. 3 DNA 测序及序列分析 扩增阳性噬菌体克隆，按常规方法提取噬菌体单链 DNA.样品送上海英潍捷基公司测序。
1. 2. 4 选择优势序列合成模拟 LTA 抗原表位的线性短肽 选择与抗 LTA 单抗结合良好的 No. 2 号所展示序列 GHxDFRQxxQPS,委托深圳瀚宇有限公司合成线性肽 L2（ Biontin-HSGHxDFRQxxQPS GGGS） ,HS、GGGS 为两端起延长和支架作用的氨基酸残基。
1. 2. 5 ELISA 鉴定 LTA 模拟短肽与抗 LTA 单抗结合特异性 抗 LTA 单抗以碳缓（ pH9. 6） 稀释，5 μg/ml 包被酶标条，4℃ 过夜。0. 25% 酪蛋白 37℃ 封闭2 h 后，依次加入系列稀释，生物素标记的线性肽 L2（ 以 1 mg/ml 起始） ,37℃孵育 1 h 后，加入 HRP-链酶亲和素 Streptavidin（ 1 ∶1 000 稀释） ,37℃ 孵育 40min,TMB 室温避光显色，2 mol / L 硫酸终止，测OD450nm.每 个 反 应 间 均 以 0. 05% PBST 洗 涤3 次。
2 结果
2. 1 三轮液相筛选回收率 以抗 LTA 单克隆抗体为靶标，采用液相筛选法筛选噬菌体 12 肽库。经 3轮筛选，噬菌体富集率达 300 倍，富集效果明显（ 表1） .所得噬菌体克隆可用于鉴定。
2. 2 噬菌体克隆与抗 LTA 单抗特异性结合 随机挑选45 个噬菌体克隆进行鉴定，得到 8 个噬菌体克隆与抗 LTA 单抗结合（ 图 1A） .选择其中与单抗结合最好的 No. 2 号噬菌体克隆纯化，10 倍系列稀释，ELISA 鉴定其与抗 LTA 单抗结合，该克隆与抗体呈剂量依赖方式结合（ 图1B） .上述结果提示液相筛选可以获得模拟 LTA 表位的噬菌体克隆。
2. 3 阳性噬菌体克隆 DNA 测序及氨基酸序列推导选择与抗 LTA 单抗结合良好的 4 个阳性噬菌体克隆送出测序，根据 DNA 序列推导出 4 条完全不同的氨基酸序列（ 表 2） .
2. 4 线性肽 L2 与抗 LTA 单抗特异性结合 基于No. 2 噬菌体克隆与抗 LTA 单抗结合，我们合成两条线性肽 L2 （ Biotin-HSGHxDFRQxxQPS GGGS） 和L2-1（ GHxDFRQxxQPSGGGS-己二胺-Biotin） .L2 和L2-1 核心序列（ GHxDFRQxxQPS） 均来自于 No. 2 噬菌体克隆，为便于检测，分别将生物素标记在 L2 肽N 端和 L2-1 肽 C 端，其中在 L2-1 肽和生物素之间加入己二胺（ 便于在合成肽 C 端交联生物素） .结果显示，L2 与抗 LTA 单抗呈剂量依赖方式结合（ 图2A） ,而在相同浓度下，L2-1 不与抗 LTA 单抗结合（ 图 2B） .上述结果提示 L2 模拟 LTA 表位。
3 讨论
目前金葡菌疫苗研究难题之一在于该病原体致病因子众多，不同临床分离株所表达致病因子不同，而且不同致病因子在感染不同阶段表达。因此有必要选择多个稳定表达于细菌表面的分子构建多价疫苗。支持这一理论的是近期 Bagnoli F. 等构建五价疫苗免疫后可诱导体液免疫应答，并在不同感染模型中具有保护作用[9].
我们选择金葡菌中保守性结构 PGN 和 LTA 作为疫苗研究候选，然而这两个分子均属于 TI 抗原，因其免疫原性弱而并不能成为疫苗。模拟肽可以作为糖脂类抗原替代物，免疫动物后可诱导记忆性免疫应答[18],模拟肽疫苗候选已用于多种病原体实验性疫苗研究[19,20].我们在前期工作中通过肽库筛选获得多条模拟 PGN 表位序列，根据其中一条序列合成四分支多价抗原肽 MAP-P31,以此抗原肽作为免疫原免疫小鼠后，可保护小鼠抵御金葡菌感染[21].在此基础上，本研究以抗 LTA 单抗为靶标筛选噬菌体肽库以期获得模拟 LTA 表位。为后续构建 PGN 模拟肽与 LTA 模拟肽双价疫苗提供实验依据。
噬菌体肽库筛选包括固相法和液相法，前者以靶标蛋白直接包被后进行肽库筛选，方法简单； 后者基于蛋白 A/G 株可结合靶标分子 IgG,则采用先将IgG 与肽库在液相中孵育，再通过与蛋白 A / G 结合后淘洗、去掉未结合噬菌体克隆。液相筛选法与固相筛选法相比优势在于避免得到非特异性吸附酶标板的克隆。我们曾尝试以固相法筛选噬菌体肽库，但回收率低，所得克隆中含非特异吸板克隆（ 数据未显示） .因此在本研究中我们采用液相筛选法，表 1 显示经三轮液相筛选，回收率逐轮提高； 而且ELISA 结果显示我们所获得阳性噬菌体克隆与 LTA单抗结合，而不与酶标板反应（ 图 1A） .上述结果说明液相筛选可行性。我们所关注的 No. 2 克隆所展示序列 GHxDFRQxxQPS 与固相筛选所得阳性克隆仅相差一个氨基酸，根据其序列所合成 L2 肽与抗LTA 抗体特异结合，提示该序列模拟 LTA 表位。这为后续构建双价合成肽疫苗提供实验数据。【图略】
