近10年来国内外MICA移植免疫反应研究综述

　　MICA（ Major histocompatibility complex class Ⅰrelated chain A） 是人类主要组织相容复合体（ MHC）Ⅰ类相关基因 A 编码的多态性细胞膜糖蛋白分子。MICA 基因位于人类第六号染色体 MHC 基因复合体Ⅰ类区域，包含长而紧密开放的阅读框，编码 MI-CA 分子.该基因由 6 个外显子组成。分别编码L-信号肽，胞膜外 α1、α2 和 α3 结构域，跨膜区（ TM） 和胞浆尾。其分子结构与 MHC Ⅰ类分子很相似，不同之处在于 MICA 分子不与 β2 微球蛋白结合，也不提呈抗原肽[2].然而，MICA 蛋白分子能够与自然杀伤（ NK） 细胞表面的活化性受体 NKG2D结合[3],激活 NK 细胞对靶细胞的杀伤功能。MICA分子主要表达在人体的成纤维细胞，血管内皮细胞和上皮细胞等。由于 MICA 基因在人群中存在多态性，Zou 等人在 Stasnty 教授实验室对 MICA 在器官移植免疫反应的作用方面进行了系统的研究，发现了人体抗 MICA 移植抗原的抗体[2-4].最早评估 MI-CA 抗体与肾移植免疫排斥的相关性[5],即移植前预存 MICA 抗体的病人组在接受肾移植术后一年的移植物存活率比没有预存 MICA 抗体的病人组显著性下降（ P < 0. 001）[4].MICA 多态性抗原具有与HLA 抗原一样的特性，而且在器官移植的病人中发现了抗供者 MICA 抗原特异性抗体（ DSA）[6].由于正常淋巴细胞表面缺乏 MICA 基因表达产物，目前临床上设计的以供者 T 和 B 淋巴细胞和受者血清进行的器官移植前交叉配型实验尚无法检测到这种抗体的存在。因此，被 MICA 抗原致敏的病人对移植物排斥可能处于高风险的状态。目前临床组织相容性配型实验室利用 MICA 虚拟配型方法可以排除这种风险。本文将对近 10 多年来国内外对 MICA在移植免疫反应研究中的进展进行简要的综述。

　　1 MICA 表达在人体血管内皮细胞表面MICA 抗原表达于内皮细胞，而外周血淋巴细胞表面则没有表达[2].我们和其他人观察到从人脐静脉新分离的内皮细胞膜上有 MICA 抗原表达[7,8].我们从分离的脐静脉内皮细胞中检测到MICA 的 mRNA 和蛋白质的表达[9].用抗 MICA 特异性单克隆抗体（ 6B3） 对细胞膜蛋白 MICA 分子进行检测，但其荧光强度不如用 W6/32 检测 HLA 的信号，表明 MICA 分子在细胞膜的表达量是有限的。

　　另外，MICA 表达在成纤维细胞、角质细胞和上皮细胞，而在正常的 CD4+、CD8+T 淋巴细胞和 CD19+B 淋巴细胞膜上则没有表达。MICA 分子在肿瘤细胞和被感染细胞可能作为一个刺激标志物表达上调[10].多种细胞膜上的 MICA 表达也不能被 IFN-γ刺激而出现上调，但有学者研究发现 MICA 可以在含有植物凝集素（ PHA） 培养基中 T 细胞上诱导表达[2].

　　2 MICA 的多态性，等位基因分型和移植供-受者的 MICA 错配

　　目前已经发现了100 种 MICA 等位基因 ,人群中 MICA 等位基因的种类及 MICA 等位基因频率之多足以使我们考虑到 MICA 在器官或者干细胞移植中的免疫作用。HLA-Ⅰ类分子多变区主要集中在抗原肽结合槽的位置，是由 HLA-I 类基因外显子 2 编码的 .而表达 MICA 可变区的基因多态性位点分散在外显子 2 和 3 之间，甚至在外显子 4也存在多态性。这些多态性形成了 MICA 两大抗原组群。由于 MICA 基因具有多态性，供受者之间 MI-CA 等位基因发生错配在当前的器官移植中是较为常见的。以受体针对供体的免疫排斥方向来计算，我们对 107 例肾移植供受者进行了 MICA 分型，仅有 29. 9%（ 32/107） 的病例无 MICA 等位基因错配，出现一个 MICA 等位基因错配的有 44. 9% （ 48 /107） .出现两个 MICA 等位基因错配的有 25. 2% （ 27/107） .即有 70% 的移植病例存在 MICA 等位基因错配。而在无血缘关系的造血干细胞移植中，由于执行严格的 HLA-A、B、C、DR 和 DQ 等位基因 10/10相配的标准和 MICA 与 HLA 基因的连锁，在这些病例中出现 MICA 等位基因错配仅占 10% 以内（ 表1） .

　　MICA 多态性的另一个特征是由外显子 5 编码的 MICA 分子的跨膜区的多态性[8].有些基因有相同的胞外区，仅仅跨膜区不同。如果不对 TM 进行分型，MICA 分型结果就会出现很多模棱两可的情况。经过对 MICA 基因分型和 TM 序列比对分析，我们将 DNA 测序技术与计算机处理相结合，开发出了一套仅用 SBT 一种方法就能进行完全高分辨的MICA 基因分型计算法，为 MICA 基因分型提供了一种实用和经济的方法。这种对 MICA 等位基因分型高分辨率的方法，在我们的日常工作中得到应用[2,11].

　　3 11 种 MICA 常见的等位基因编码可溶性重组蛋白的制备

　　MICA 抗原是一种表达于人体内皮细胞、上皮细胞和纤维细胞表面的多态性糖蛋白，临床组织配型中使用的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞都没有表达。为了解决 MICA 抗原配型问题，我们决定尝试生产重组可溶性 MICA 抗原来检测 MICA 抗体。这项工作在邹教授和他同事们的努力下，首次报道了 MI-CA 抗体检测的 Luminex flow cytometry 方法[12].为了分析 MICA 是否为移植患者血清中抗供者特异性的靶抗原，我们首先通过昆虫细胞蛋白表达系统，制备由 α1 、α2 、α3 组成的 MICA 重组蛋白。这些结构包含了信号肽和 MICA* 001、MICA* 002、MICA* 004、MICA* 006、MICA* 007、MICA* 008、MICA* 009、MICA* 012、MICA* 017、MICA* 018 和 MI-CA* 019 的细胞外结构域。另外还包含一个六个组氨酸（ His6） 的 His-tag 标签序列作为蛋白纯化之用。

　　通过基因分子克隆把常见的 MICA 等位基因编码序列整合至能感染昆虫细胞的 Baclo 病毒载体，昆虫细胞表达的可溶性 MICA 重组蛋白从昆虫细胞的培养液中提取和纯化出来。之后再将其与 Luminex 珠子结合[5],制成试剂盒。

　　4 抗同种异体（ Allo） MICA 抗体的鉴定和抗原表位的分析
　　
　　在肾移植术后的病人血清中，我们检测到抗MICA 等位基因产物的特异性抗体。研究资料表明病人接受输血和妊娠可能是 MICA 致敏的两个机制[13].这种抗同种异体（ Allo） 抗体对病人自身血管内皮细胞表面的 MICA 是没有结合作用的，但对异体移植物中错配的 MICA 分子可能呈现抗体的结合反应。这提示了 MICA 可能在排斥反应中作为免疫排斥的靶分子[12],即移植抗原，刺激受者的免疫细胞，出现细胞性和体液性的排斥反应。目前对MICA 参与的细胞免疫反应研究很少[14],而对体液免疫反应的研究有很多文献报道。我们最早研制用于检测 MICA 特异性抗体的试剂盒，并应用于第 15次和第 16 次国际组织相容性和免疫遗传学协作会议（ IHWS） MICA 专题协作的研究[15].

　　对 MICA 抗体的检测采用了 11 种常见的 MICA等位基因的重组抗原。然后将抗原与悬液芯片的聚苯乙烯磁珠相耦合，制成 Luminex 抗原阵列，应用ELISA 的原理，实现对血清样本的 MICA 抗体的检测和特异性的区分。另外，利用基因克隆技术，将两大组的 MICA 表达序列进行转换，形成两个新的杂合分子，帮助对 MICA 抗体的识别抗原表位的关键氨基酸的定位[13].HMy2. CIR 细胞（ 无 MICA 表达） 经转染 MICA* 001、MICA* 002、MICA* 008 和MICA* 009 表达 DNA 序列，建立了 MICA 稳定表达的细胞株。对 MICA 抗体的鉴定的基本过程是首先确定血清与 MICA 结合的 Luminex 珠子反应强度，然后用 MICA 转染的细胞对血清样本中的 MICA 抗体进行吸附，而这些用于抗体吸附的转染细胞的MICA 等位基因是已知的。最后将吸附的抗体用酸洗脱的方法洗脱下来[13].将吸附前的血清，吸附后的血清和洗脱液分别用 Luminex MICA 单抗原微珠再次进行检测。经数据处理和 MICA 不同等位基因的氨基酸序列比对等过程，我们确定了 14 种 MICA抗体的血清型： 包括抗体只识别单个等位基因、一些抗体可同时对 2,3,或 4 个等位基因抗原起反应、一些较大的宽特异性的 MICA 抗体，如抗 MICA-G1 和MICA-G2 组特异性抗体 IgG,其识别 MICA 抗原表位的 6 个氨基酸完全相反。证实我们以前的假设：MICA 抗体是抗同种异体抗原的抗体，不是一种自身抗体。Duquesnoy 和他的同事通过计算机分析抗原表位而获得相似的结果[16].通过的商业试剂将MICA 重组蛋白质结合到 Luminex 珠子上，分析 6 个血清移植受者反应性，发现的 MICA 抗体结合模式与计算机分析的结果相一致。

　　5 肾移植的排斥反应： 移植物洗脱液中抗体的分析

　　Zou 等[5]研究小组最早评估 MICA 抗体与肾脏1移植排斥病人洗脱液的标本。这组样本来自 14 个由于超急性排斥反应，15 个由于急性排斥和 30 个由于慢性排斥反应被切除的移植肾的洗脱液。其中的一些受者系再次接受肾移植手术的病人。应用已经建立的 MICA 抗体检测方法[5],对这些洗脱液的样本进行了抗体的检测。结果表明，在 11 个标本中检测到抗 MICA 抗体。在一些病人的洗脱液中同样可以检测到 HLA 抗体。在其中 6 个洗脱液中，MI-CA 抗体和 HLA 抗体均呈阳性反应； 17 个样本中仅仅发现了 HLA 抗体； 在 5 个洗脱液中，仅仅发现了MICA 抗体，对其中一例 MICA 抗体阳性的病例进行了 MICA 等位基因的测序分型，证实洗脱下来的抗体就是抗排斥肾移植物特异性抗原的抗体（ DSA） .

　　这些结果提示 MICA 抗体参与了肾脏排斥反应[5].

　　6 移植前患者体内含有 MICA 抗体降低肾脏移植物的存活率在一项国际大协作回顾性研究项目中，收集最近 10 多年的肾移植血清样本，这些病人的血清标本被进行双肓的 MICA 检测和临床数据连接。统计分析结果显示： 移植前血清中抗 MICA 抗体的存在与移植失败有相关的关系。这种现象在 HLA 相匹配良好，无 HLA 抗体或初次移植的病例中更为显著[17].应用 5 种常见的 MICA 等位基因表达的抗原，如 MICA* 001、MICA* 002、MICA* 004、MICA* 008 和 MICA* 009 等，我们对 1 910 例肾移植受者的血清标本进行相应的 MICA 抗体（ IgG） 的检测。

　　对移植后的第 3、6、12 个月的移植物功能进行了随访资料分析。在有 MICA 抗体的病人组和没有 MI-CA 抗体的病人组之间利用 long-rank 分析以比较移植物存活率的差异。此外，也进行了多因素的 Cox回归分析。由于供者的 DNA 不可得，病人体内的MICA 抗体是否针对供者的特异性 MICA 表位，无从得知。在被研究的 1 910 例患者中，有 217 名（ 11. 4%） 患者体内含有 MICA 抗体。统计结果表明MICA 抗体与肾移植失败是相关的，可能是因为排斥反应。相匹配的受者（ 0 或 1 错配的 HLA-A、HLA-B、HLA-DR） 和没有 HLA 抗体的病人（ PRA =0） 显示，MICA 抗体的存在与移植物的丢失明显相关。

　　7 肾移植后受者体内抗 MICA 抗体的产生在与 Steve Cox 和其同事合作一项的研究中[6],大量肾移植病例及其标本被分析和检测，用来确定MICA 抗体是否是供者特异性的，超过 200 病例的受者和相应的供者进行了 MICA 基因分型以及 MI-CA 抗体测定。三个不同来源的 MICA Luminex 试剂盒被使用，至少两个被解读为阳性则被认为阳性标本。结果显示，在肾移植后新产生的抗体，与供者MICA 错配的等位基因有关。这些抗体与活检确定的急性排斥反应有关，与移植物功能降低显著相关。

　　这些数据提示 MICA 作为移植抗原在慢性移植物损害和失功的免疫排斥反应中起作用。尽管在 MICA匹配的受者体内发现了 MICA 抗体，而 94% 的受者因 MICA 错配在肾移植后产生了 MICA 新生抗体。可以推断 MICA 基因的错配是导致 MICA 抗体的产生的原因，这通常发生于移植的一年后，并且 MICA抗体与急性排斥反应具有很强的相关性。

　　8 器官移植受者 MICA 抗体的频率

　　目前的试剂可以检测到 MICA 抗体，而其与供者错配的等位基因致敏有关。可以通过转入 MICA特定等位基因的转染细胞吸附特定抗体，获得洗脱液与原血清相同的血清学的模式.而这些抗体在没有接受器官移植的个体中并不常见。根据我们的统计数据，在等待第一次肾移植的病人中大概有10% 的人含有 MICA 抗体，接受肾移植后的病人含有 MICA 抗体人数有所增加。如前所述，这种抗体的产生是抗供者特异性的。这些抗体是针对供者错配的 MICA 抗原表位的，并且与器官移植排斥反应相关。根据我们的经验，大概有 20% 的器官移植受者含有 MICA 抗体。当供者和受者 MICA 等位基因完全匹配时，而这些抗体并不增加。我们还进一步发现，如果病人先前发生了器官排斥反应，则病人体内的 MICA 抗体增加程度有所提高。在这些被排斥的肾移植病人中，有多达 30% 的病人被检测到 MI-CA 抗体.

　　9 供者 MICA 抗体与移植肾功能丧失相关联有很多关于 MICA 抗体在肾移植中的作用的研究[4,5,18-21].研究结果表明，在大多数情况下，HLA仍然是器官移植排斥反应的主要组织相容抗原。相对而言，抗 MICA 抗体的独立作用不容易确定。然而，有一些报道有 30% 的病人即使用 Luminex 高敏感性的方法也检测不到 HLA 抗体的存在，表明移植失败与 MICA 抗体之间存在独立的相关性。在与Steve Cox 和其同事合作的研究中,检测 MICA 抗体是抗供者特异性的。也有研究表明，MICA 抗体还有针对供者之外的 MICA 其他表位的抗体，这些研究显示了更为复杂反应模式.

　　10 MICA 抗体与心肺移植排斥有关Suarez-Alvarez 和其同事发现，MICA 抗体与心脏移植的受者的排斥反应有关,我们发现，HLA/ MICA 同种异型抗体与心脏移植后冠状动脉疾病（ CAD） 相关联。没有抗体的受者，80% 不会发展为冠状动脉疾病（ CAD） .仅含有 MICA 抗体的受者组中发生 CAD 的比率为 56%.同时含有 HLA 和 MI-CA 抗体的受者组仅有 30% 病例不会发展为 CAD.

　　数据表明体内含有 HLA 和 MICA 抗体的受者发展为 CAD 风险极高（ P <0. 001） .另外，MICA 抗体与肺脏移植的慢性排斥反应相关.研究结果提示加强对器官移植病人术后 HLA 和 MICA 抗体的监测具有重要的临床意义。

　　11 MICA 虚拟配型。

　　受者体内 MICA 抗体通过识别错配的 MICA 抗原表位产生。体内 MICA 抗体与肾脏移植排斥相关。因此检测 MICA 抗体有很大的实际临床意义。因为 T 和 B 淋巴细胞交叉配型试验根本检测不出MICA 抗体。而取供者的血管内皮细胞做交叉配型不易做到。但在确定 MICA 抗体的特异性和供受者的 MICA 分型之后，对供者错配的 MICA 抗原表位进行分析，可以从理论上预测实际中供者血管内皮细胞与病人血清交叉反应的结果。这个“虚拟交叉配型”可以用来为已经致敏的病人（ DSA） 选择合适的供体，特别是避免选择排斥风险高的供体。我们有这样的典型病例（ 未发表） ,在第一次肾移植时未进行 MICA 抗体检测，移植一个月后肾被排斥。MI-CA 抗体分析表明病人在第一次肾移植前已经有很高的抗 MICA-G1 抗原的抗体（ DSA） ,在第二次移植中应用 MICA 虚拟配型方法，避开选择不适宜的供者后，再次肾移植获得成功。如果病人先前发生了器官排斥反应，则病人再次接受器官移植后，其体内MICA 抗体含量会有所增加。MICA 抗体特异性一旦确定下来，对供者的 MICA 基因分型结果进行分析，就可以通过一个所谓的“虚拟配型”方法来为临床器官移植的供体选择提供参考。鉴定 MICA 抗原表位对于分析患者血清中 MICA 抗体的特异性以及评估对潜在供体是否产生排斥反应的风险具有十分重要的意义。

　　12 结论

　　MICA 抗原表达于内皮细胞表面，具有多态性，并且在移植受体引起免疫反应，包括针对错配抗原表位产生体液免疫和细胞免疫反应。早期的研究显示，MICA 抗体与移植存活率降低相关联。最近更多的研究表明，MICA 抗体是针对供者错配的 MICA抗原产生的，目前已有成熟的实验检测方法，可以对MICA 抗体的特异性进行分析，应用 MICA 转染的细胞对血清抗 MICA 抗体的吸收和洗脱，已经证实了MICA 抗体的多种血清型及识别的相对应的 MICA抗原表位。大量的研究资料证实 MICA 抗体与器官移植的急性排斥和慢性移植排斥相关。MICA 在免疫排斥反应中起着独立的作用。部分解释在 HLA完全匹配的病人中依然发生器官移植排斥反应的原因。MICA 抗原的错配能够产生新生的抗 MICA 抗体，在加速器官移植的慢性排斥反应进程可能起着一定的作用。这些结果进一步强调 MICA 作为移植抗原在移植免疫中发挥作用。因此，在器官移植配型实验中，考虑 MICA 的抗体检测和 MICA 抗原的分型，进行 MICA 虚拟配型对进一步降低移植排斥的风险具有重要的临床意义。