羊膜作为一种生物材料用于外科已有 100 多年的历史，1910 年首次报道了羊膜成功应用于皮肤移植[1].近年研究发现，人 羊 膜 上 皮 细 胞 （ human amniotic epithelial cells,hAECs）具有部分干细胞特性，表达干细胞的标记物，可分化为三个胚层不同类型的细胞[2].由于 hAECs 取材方便、易于分离，成为细胞治疗和再生医学的有利工具。2010 年国际胎盘干细胞协会 （International Placenta Stem Cell Society,IPLASS）成立，致力于推动胎盘来源干细胞的基础研究和临床应用，也标志着胎盘来源干细胞已得到越来越多研究者的关注。本文就 hAECs 的来源、生物学特性等方面，对其临床应用前景进行总结论述。
1 hAECs 的来源
羊膜（amniotic membrane,AM）属于胎儿附属物，是胎膜和胎盘的部分组织。羊膜组成胎膜和胎盘的最内层，并覆盖脐带表面，与胎儿皮肤相连。羊膜为半透明薄膜，结实、坚韧而柔软，光滑，无血管、神经及淋巴。正常羊膜厚 0. 02 ~ 0.05mm,由羊膜上皮 （ amniotic epithelium,AE） 和结缔组织构成[2].羊膜上皮由单层的羊膜上皮细胞构成。羊膜是高变异性的组织，位于胎盘表面的羊膜上皮层为柱状上皮细胞，周围部分的羊膜上皮层是扁平上皮细胞。羊膜与羊水直接接触，电镜下可见羊膜上皮细胞表面有微绒毛，使羊水与羊膜间进行物质交换。
通常可将羊膜与绒毛膜机械分离，并通过胰酶等进行一1growth factor,EGF）存在的培养基中，hAECs 通常可生长 2 ~ 6代。低密度的状态下生长较缓慢。体外培养的 hAECs 呈中等大小的圆形细胞，核居中或偏于一侧，可有一个或两个细胞核，胞质丰富。hAECs 的增殖呈典型的鹅卵石样上皮细胞形态。hAECs 在自分泌的转化生长因子（transforming growthfactor-β，TGF-β）的作用下，可自发经历上皮-间充质转化（ep-ithelial-mesenchymal transition,EMT）[3].
2 hAECs 的生物学特性
2. 1 hAECs 表达干细胞标记物 hAECs 在体外培养条件下，可表达间充质干细胞标记物；此外，hAECs 还可表达胚胎干细胞标记物、多能干细胞标记物等[4 - 5].间充质干细胞标记物：CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、HLA-A,B,C、CD13、CD10、CD166、CD49e、CD117 （ 表达量极低 ） ,并且不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR.胚胎干细胞标记物：阶段特异性胚胎抗原 SSEA-3、SSEA-4,肿瘤排斥抗原 TRA 1-60、TRA1-81.多能干细胞标记物： octamer-4 （ OCT-4 ）、NANOG、sexdetermining region Y-box 2 （ SOX-2 ）、Lefty-A、FGF-4、REX-1,and teratocarcinoma-derived growth factor 1（TDGF-1） （cripto-1）。 其 他： CD324 （ E-cadherin ）、CFC1、DPPA3、PROM1、PAX6、CD140b、GCTM2、ATP 结合盒转运蛋白 G2 （ ABCG2 /BCRP）、CD9、CD24、整合蛋白 α6、β1、c-met（肝细胞生长因子受体）。
原代 hAECs 中，SSEA3、SSEA4 和 TRA 阳性的细胞分别为 15%、50%和 5% ~10%[4].显着大于成体干细胞的比率（0. 1% ~0. 01%）。Miki 等[6]认为，原肠胚形成是器官发生的开始，由于 hAECs 发生于原肠胚形成前，加之羊膜腔的阻隔，原肠胚的短程器官形成信号分子可能不能完全作用于成羊膜细胞，因此保留有较多的干细胞特性。
2. 2 hAECs 的免疫特性 羊膜应用于多种外科治疗已有100 多年，包括皮肤烧伤、皮肤创伤后修复、腿部溃疡等不同部位的创伤[7],泌尿生殖道及颌面部等部位重建手术，以及多种溃疡表面的重建[8],均未出现免疫抑制或急性排斥反应。羊膜细胞的免疫特性表现在其特殊的免疫分子表达谱。
hAECs 低表达 MHCⅠ类分子（HLA-A,B,C,G） ,不表达 MHCⅡ类分子 （ HLA-DR），还表达 HLA-G、CD80 （ B7-1）、CD86（B7-2）、CD40 和 CD40L[9].hAECs 持续性表达非典型 MHCⅠ类分子 HLA-G.通常持续性表达 HLA-G 的组织为免疫豁免组织，如睾丸、卵巢、胎儿细胞。HLA-G 有重要的免疫调节功能。主要由 ILTR 识别，表达于 T、B 淋巴细胞、NK 细胞、树突状细胞表面，结合后消除活性信号。hAECs 是一类免疫豁免细胞，能在免疫不相容的异体移植受者体内存活。在无免疫抑制剂的作用下，异体移植的羊膜或 hAECs 仍不发生急性免疫排斥反应。体外实验中，从羊膜中分离的细胞不表现出同种和异种的免疫反应，并且能较强地抑制淋巴细胞增殖。
体内实验证实，人羊膜和 hAECs 可移植到同种和异种的具有免疫功能的动物体内，未表现出免疫排斥。人羊膜和 hAECs能在有免疫力的动物，如兔、鼠、豚鼠、帽猴体内长期存活，提示这类细胞不具有免疫原性。此外，在无免疫抑制治疗的情况下，将人羊膜和 hAECs 应用于外科治疗，也均未见急性排斥反应。
3 hAECs 的临床应用前景
hAECs 可表达干细胞标记物，提示其可能具有干细胞特性。与人胚胎干细胞一样，hAECs 不具有形成单个细胞克隆的能力，并且由于其基因稳定性，在移植入异种动物体内也不形成畸胎瘤[4].因此，只能通过构建嵌合体小鼠验证其干细胞特性。在体外条件下，利用小鼠的胚胎干细胞和人羊膜细胞诱导成嵌合体小鼠。在嵌合体小鼠胚胎中，三个胚层中均有人细胞的分布[10].尽管该细胞系为人 hAECs 和羊膜间充质细胞的混合，仍成功揭示了羊膜细胞的多能性。进一步的研究证实，hAECs 在体外诱导条件下可分化为三个胚层的细胞，包括外胚层的神经元和神经胶质细胞[11],中胚层的心肌细胞肌细胞、骨细胞、脂肪细胞[12],内胚层的肝脏[13]和胰腺细胞[14]等。
3. 1 hAECs 在神经系统疾病治疗中的应用前景 hAECs 在治疗中枢神经系统疾病方面有着巨大的潜力。1996 年Sakuragawa 等[15]发现，体外培养的 hAECs 表达神经元和神经胶质细胞特异性蛋白，自此 hAECs 就开始被用于细胞治疗的研究。随后有研究证实，hAECs 还可合成分泌乙酰胆碱、儿茶酚胺、多巴胺。进一步实验也证实，hAECs 可表达神经标记基因，如神经特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、髓鞘碱性蛋白、微管相关蛋白-2、胶质原纤维酸性蛋白等[4].利用腺病毒标记系统证实，约 20% 的 hAECs 表达少突胶质细胞标志基因，如髓鞘碱性蛋白、蛋白质脂蛋白（PLP）和 2',3'-环腺苷酸-3'-磷酸二酯酶（CNPase）。
帕金森病（Parkinson's disease,PD）是由脑黑质的多巴胺（dopamine,DA） 神经元的进行性死亡导致。将 hAECs 移植入免疫抑制的 PD 大鼠模型，可改善其 DA 神经元退化作用，并且其功能明显恢复[16].这可能通过分泌 DA 和其他可溶性分子发挥作用。在非免疫抑制的大鼠中的进一步实验证实，hAECs 移植的大鼠脑黑质中 DA 和 DOPAC（3,4-二羟基苯乙酸）分泌明显增加，脑脊液中 DA 含量明显增加[17].此外，hAECs 对于脑卒中、脊髓损伤等神经系统疾病有着潜在的治疗前景。hAECs 移植入大脑中动脉闭锁的模型中，可迁移到缺血区域，减少梗死面积，提高行为功能[18].hAECs 移植入脊柱横断的猴子中，可促进轴突迅速增长，并且抑制了脊柱微神经元的死亡[19].通过行为评估，移植后的 hAECs能在损伤的急性期起到神经保护的作用，并且在长期恢复过程中促进长纤维束的再生，而改善脊髓损伤动物的功能。大量体内体外实验证明，hAECs 可能通过分化为神经细胞，或分泌神经营养因子而起到改善疾病的作用。
3. 2 hAECs 在心脏疾病治疗中的应用前景 由于成熟心肌细胞的不可再生性，利用干细胞移植重建病损心脏丧失的心肌细胞、改善缺血心肌的功能，被视为有临床应用前景的、治疗冠心病尤其是急性心肌梗死的新途径。Miki 等最早对hAECs 可分化为心肌细胞做出了研究，在 hAECs 培养基中添加抗坏血酸培养14 天后，通过 RT-PCR 可检测到心房型肌球蛋白轻链（MLC-2A）、心室型肌球蛋白轻链（MLC-2V）、GA-TA-4 及心肌细胞特异性转录因子 Nkx 2. 5 的表达[4].体内实验证实，将人羊膜块移植入大鼠心肌缺血模型，明显改善了缺血后心脏功能；实验组动物表现为心脏收缩功能提高、左室短轴缩短率提高和室壁增厚；但在大鼠心肌组织中未检测到人细胞。提示这些功能的改善应是羊膜细胞分泌的调节因子的作用，起到了保护和促进宿主组织再生[20].然而，不同于组织块的移植，hAECs 注射入心肌梗死的大鼠模型的心肌梗死区域 4 周后，存活的 hAECs 中 3% 可表达心肌特异性蛋白肌球蛋白重链。实验组动物的心脏射血分数升高，PET 及组织学显示梗死区域减少，梗死区域心肌基因和蛋白表达增高。证实了 hAECs 在体内条件下可分化为心肌样细胞，减少梗死区域，改善心肌功能[21].因此，羊膜和 hAECs改善心肌缺血其中的机制有两种可能：一是移植细胞分化为心肌细胞或者血管内皮细胞和平滑肌细胞；二是移植细胞刺激了血管生成和预防了心肌细胞的死亡。
3. 3 hAECs 在肝脏疾病治疗中的应用前景 近年肝脏移植成为治疗晚期肝脏疾病的新方法，但却受到肝脏来源短缺的限制。hAECs 具有分化为肝脏细胞的能力，成为潜在的移植来源。Sakuragawa 等[22]报道，体外培养的 hAECs 可分泌白蛋白（Alb）和甲胎蛋白（AFP）。进一步研究发现，未分化的hAECs 表达白蛋白、α-抗胰蛋白酶、α1-AT、CK-18、CPS-1、PEPCK 等肝细胞基因，而诱导后的 hAECs 表达 α1-AT、CK-18、CPS-1、CYP3A4、PEPCK 等肝脏相关基因量增加，并且可合成分泌白蛋白、贮积糖原[23].通过外源性生长因子刺激方案诱导 hAECs 分化为肝脏细胞，能分泌多种成熟肝脏特异性标志蛋白，其中包括重要的药物代谢相关的细胞色素 P450基因。羊膜块移植入 SCID 小鼠腹腔后可存活并在小鼠的血清和腹水中可检测到人白蛋白的分泌[23].hAECs 移植入SCID 小鼠的肝脏后，表现为 Alb 和 AFP 阳性，并且融合为肝脏实质组织[22].hAECs 移植入免疫缺陷小鼠后，在小鼠血清中检测到人 α1-抗胰蛋白酶，可进一步证实移植入的hAECs 可发挥肝脏细胞的功能。最近研究发现，小鼠肝脏细胞、基质胶或猪肝脏细胞来源的胞外基质，可增加 hAECs 分化为肝脏细胞的能力。其中猪肝脏细胞来源的胞外基质培养的 hAECs,其白蛋白和多种 CYP 基因表达增加最明显。三明治培养等 3D 培养法可明显增加这类细胞的功能和活性。
倒千里光碱处理的肝脏 60% 切除小鼠，经脾移植入 hAECs 6个月后，可在肝脏组织中检测到人源细胞[24].在诱导分化为肝脏细胞的 hAECs 中，目前可检测到至少 30 个在成熟肝脏细胞表达的基因，提示 hAECs 可成为潜在的移植来源。
hAECs 也为 A1AT 缺陷的肝脏和肺疾病等提供了新的治疗思路。
4 结 论
人羊膜上皮细胞由于特殊胚胎发育来源，仍保持着部分干细胞特性。大量体内、体外实验都已证实了其潜在的治疗效果。但 hAECs 不具有长期自我更新和形成单个细胞克隆的能力，其究竟是一种可分化为三个胚层的多能干细胞还是多种各系祖细胞的混合物，仍需进一步的研究。但在临床应用方面，hAECs 具有独特的优势：首先，hAECs 可分化为三个胚层不同类型的细胞，多种疾病模型实验也证实其潜在的治疗效果。其次，由于 hAECs 基因的稳定性，移植入免疫缺陷的动物后无致瘤性。人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞具有确切的干细胞特性和分化能力，而与之伴随的是其致瘤性。加之 hAECs 特殊的免疫特性，在治疗的安全性方面，hAECs 具有明显的优势。再次，由于 hAECs 取自于人胎盘羊膜，易于分离培养。胎盘通常作为医疗废弃物，hAECs 的实验和研究可在一定程度上避免道德伦理等问题。总之，hAECs 在临床应用方面具有广阔的前景，未来的研究将无论是在其基本生物学特性方面继续深入，还是就其诱导分化能力方面进一步展开，都将有利于其临床应用的推进。hAECs无疑将成为细胞治疗和再生医学的有利工具。
