0、 引言
毒死蜱是目前我国允许使用的低毒有机磷农药之一,具有胃毒、触杀、熏蒸三重作用,对蔬菜、果树等上的多种害虫均有较好防效。残留在蔬菜或水果中的有机磷进入到有机体内具有积累效果,会对生物体内胆碱酯酶有抑制作用,使其失去分解乙酰胆碱的能力,造成乙酰胆碱积累,引起神经功能紊乱,从而导致肌体的损害。GB2763 - 2005 规定毒死蜱在梨果类和柑橘类水果中的最大残留限量分别为 1mg/kg 和2mg / kg。现在比较成熟的理化检测方法步骤复杂,所用时间长,且仪器昂贵,难以普及。国内外开展的酶抑制法、免疫分析法、生物传感器技术、单一的光谱技术等快速检测方法取得了很大进展,但仍有其不足之处。为此,采用比色分光光度法,根据氯化钯和含硫基的有机磷反应可以生成黄色络合物硫化钯这一原理,对苹果中毒死蜱农药进行比色预处理,用分光光度计采集 400 ~800nm 可见光波段的光谱特征吸收峰,发现毒死蜱农药的浓度和吸光值之间存在明显线性关系,满足了水果类最大残留限量为 1 mg/kg的检测要求。建立了毒死蜱农药的标准模型,从而可以判断该类农药残留及含量。同时,对比了用乙酸代替常用的浓盐酸溶解氯化钯的效果,实验证明用乙酸做溶剂不仅操作安全,且吸光度谱图更光滑、在毒死蜱较高浓度时吸光值区分更明显,相关系数更高。用氯化钯乙酸比溶液对毒死蜱进行预处理时比色反应的时间和温度对测试效果的影响很大,因而分析并确立了比色试剂的最佳配制方法和条件,为进一步开发便携式农残检测仪器的光源提供了参考依据。
1、材料与方法
1. 1 材料与试剂
40% 的毒死蜱乳油农药购自北京嘉禾种业有限公司; 去离子水、乙酸(分析纯) 、氯化钯晶体、乙醇(分析纯) 均购自北京蓝弋化工公司。用乙醇分别配置浓度为 0. 5、1、2、4、8、16mg/kg 的毒死蜱溶液。
第 1 种方案: 氯化钯 0. 25g,滴入 0. 5mL 浓盐酸,加去离子水稀释到 50mL,配成 0. 5% 的氯化钯盐酸溶液。室温下,用 2mL 的 0. 5% 氯化钯盐酸溶液和上述各浓度的毒死蜱溶液 5mL 分别发生比色反应,振荡摇匀放置 2min,放入比色皿中用分光光度计进行吸光度光谱扫描。
第 2 种方案: 氯化钯 0. 25g,加入 3mL 的乙酸,振荡、搅拌 5min,加去离子水稀释到 50mL,配成 0. 5% 的氯化钯乙酸溶液。水浴 45 ℃下放置 30min,充分溶解成橙黄色液体,用 2mL 的 0. 5% 氯化钯乙酸溶液和上述各浓度的毒死蜱溶液 5mL 分别发生比色反应,振荡摇匀 2min,放入比色皿中用分光光度计进行吸光度光谱扫描。
两种方案分别以不添加毒死蜱农药的氯化钯盐酸和氯化钯乙酸溶液调节零点: 在两个比色皿中放入配置好的氯化钯盐酸或氯化钯乙酸底液,放入扫描仪中调零后,其中一个始终作对比,测试比色反应后溶液的吸光值,以消除比色皿和氯化钯底液的影响。发现两种情况下调零线均在 400 ~900nm 之间比较平坦光滑,即在 400 ~ 900nm 波段分别采集两种方案的吸光度谱图。
1. 2 材料与试剂
UV - 2450 紫外 / 可见 / 分光光度计,日本岛津集团,分辨率 0. 1nm,可用于各种有机、无机固体或液体的光学特性。该仪器具有测量速度快、测量结果准确等特点,选定测量波长范围 400 ~900nm。采集的数据上传至计算机,利用软件 UVPRO 进行光谱预处理。
2、 结果与分析
2. 1 第 1 种方案实验结果与分析
图 1 是用浓盐酸溶解氯化钯后和不同浓度毒死蜱发生比色反应后溶液的吸光度谱图。可以看出,虽然毒死蜱浓度不同时,溶液吸光度值也不同,但是在 400~ 500nm 区间,噪声干扰较大。
利用移动平均滤波器(窗宽 15) 进行平滑降噪处理后的波形如图 2 所示。其中,0mg/kg 表示没有加入毒死蜱即氯化钯盐酸溶液的吸光度谱图,在 400 ~800nm 范围内吸光度几乎为 0。不同浓度毒死蜱发生比色反应后的吸光值和农药浓度有明显的负相关关系,即可以利用比色反应后的溶液吸光值反映毒死蜱的浓度。但是,当毒死蜱的浓度较大 (8mg/kg 和16mg / kg) 时,吸光值的区分不明显。
2. 2 第 2 种方案实验结果与分析
图3 是氯化钯乙酸溶液和不同浓度毒死蜱反应后的吸光度谱图。可以看出,两种方案下光谱的走势在 400 ~550nm 范围内并不相同。用氯化钯乙酸溶液的效果更理想一些:不需要平滑降噪处理,在8mg/kg 和16mg/kg 处吸光值的区分比较明显。对比两种方案在各波长下的相关系数(如图4 所示) ,用氯化钯乙酸溶液预处理后的相关系数明显增大。由此认为,用乙酸代替浓盐酸溶解氯化钯晶体虽然溶解时间要长一些,却大大提高了操作的安全性和检测的可靠性,且在415 nm 处有最大负相关系数 R = -0.8874,在毒死蜱浓度为 0. 5 ~ 16mg / kg 范围内具有较好的线性关系。根据比色测定原理,确定最佳波长为 λmax= 415nm。
2. 3 反应中氯化钯乙酸比色体系的配置条件
常温下氯化钯是铁红色晶体粉末,难溶于水,易溶于酸,但在乙酸中的溶解速度很慢。实验中,水浴加热到 45 ℃,且用玻璃棒不停搅拌会使溶解的速度大大加快,放置时间为 30min 时会充分溶解成橙黄色液体。由于溶液不稳定,乙酸挥发性强,放置时间过长(实验中超过2h) ,比色反应后吸光值不能再反应毒死蜱的浓度,所以氯化钯在乙酸中充分溶解后应立即和毒死蜱反应。
2. 4 比色反应单因素的确定
实验发现,比色剂的添加量、反应时间和温度对吸光值的影响较大。对 4mg/kg 的毒死蜱比色反应分别在比色剂添加量 0. 5 ~10. 5mL(浓度为 0. 5% ,每添加 1 mL 测试 1 次) 、温度 25 ~ 50 ℃ (每隔 1℃ 测试 1次) 和反应时间 0. 5 ~ 5min(每隔 5s 测试 1 次) 进行415nm 处吸光值的单因素测试。经反复测试,比色剂的添加量测试是在温度为 25℃,反应时间为 2min 的条件下; 温度测试是在比色剂添加量为 2mL,反应时间为2min 的条件下; 反应时间测试是在比色剂添加量为 2mL,温度为 25℃。表 1 为选取的各单因素典型值所对吸光值的变化,最终确定毒死蜱浓度为 0. 5 ~16mg / kg 时,该比色反应的最佳条件为: 比色剂添加量为 0. 5% 的氯化钯乙酸溶液(氯化钯和乙酸的量参见1. 1 第 2 种方案) 2mL,温度 45℃ ,时间 2min。
2. 5 建立一元回归模型
利用 Excel 在波长为 415 nm 处分别建立毒死蜱浓度和吸光度的线性、对数和多项式的一元回归曲线。数学公式和对应的相关系数如表 2 所示。可见,毒死蜱浓度和吸光值之间存在着比较明显的对数关系,在这种关系下,相关系数 R2= 0. 992 8。
3、 实验验证
分别配置浓度为 16、8、4、2、1、0. 5mg/kg 的毒死蜱溶液各 1 组,每组取 10mL 均匀喷洒在 5 个无公害苹果上,在24 ℃条件下晾干待用。取6 组喷洒有不同浓度毒死蜱溶液的苹果样品各 20g,将其粉碎并和乙醇混合并超声搅拌 60min,取上清液,并用过滤纸过滤; 提取和过滤两次,过滤液用 10mL 乙醇漂洗,浓缩、干燥后,用蒸馏水溶解并定容到 5mL。对 5 组样品分别按照1. 2 第2 种方案进行预处理后,测试其吸光度,每个样品重复测量 3 次,取平均值作为分析用数据。
样品的加标回收率分析结果如表 3(其中加标回收率是指在空白的无公害苹果样品中加入定量的检测物质毒死蜱,然后用检测量除以添加量,n 是重复的次数) 所示。结果表明,毒死蜱农药的加入量和回收量基本相符,回收率为 91. 6% ~108. 9% 。
4、 结论
从安全、快速检测水果中毒死蜱农药残留的角度出发,用氯化钯作为比色剂,对比研究了用乙酸代替常用的浓盐酸溶解氯化钯后比色反应溶液吸光度谱图的效果。实验证明,乙酸代替浓盐酸后,消除了 400~ 500nm 范围的噪声干扰、明显区分了 8mg / kg 和16mg / kg 的吸光值,各波长下的相关系数也明显增加,且在 415nm 处有最大吸光值。以无公害苹果为代表进行了实验验证,样品回收率在 92% ~105. 3% 之间。
按照上述方法获得的吸光度谱图在 415nm 处可以测定 1mg/kg 的毒死蜱浓度,满足了我国对水果类的检测要求。但是,从一元回归模型可以看出,毒死蜱浓度和吸光度的线性关系较差,而且氯化钯的价格较高,在这两方面可以继续改进试验方法,以获得更理想的效果。
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