现今,食品安全问题越来越受人们关注,食品经常会受到一些肠道致病菌的污染,引起细菌性食物中毒。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。
1、 大肠菌群及其检测意义
大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。在GB4789.3-2010中对大肠菌群的定义为:在一定培养条件下(36℃±1℃,培养48h±h)能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。消费者如果食用了大肠菌群超标的食品,会引起急性中毒,反应出发热、呕吐、腹泻、腹痛等症状。因此,大肠菌群是食品卫生质量的重要指标之一,大肠菌群的检测也是食品检测分析的重要环节。
2、 大肠菌群测定方法
目前, 我国现行的食品大肠菌群检测标准主要以国家标准“GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群M P N 计数法”为主。
2.1 检样稀释
以无菌操作将检样做成10倍递增匀液,根据该类样品的卫生要求对样品污染情况作出估计,选择三个适宜的连续稀释度。
2.2 初发酵试验
将选择好的三个适宜的连续稀释度的样品匀液接种于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤发酵管内。接种量在1ml以上的,用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤发酵管;1ml及1ml以下的,用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤发酵管,每个稀释度接种三管。
2.3 复发酵试验
挑取可疑的培养物(月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤发酵管中产气)移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管中,凡产气者,计为大肠菌群阳性。
2.4 报告
根据确证2.3的大肠菌群阳性管数,查MPN表检索表报告。
3、 注意事项
3.1 培养基的类型对大肠菌群检测结果的影响。
GB4789.3-2010使用的培养基是:月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤,煌绿乳糖胆盐肉汤。GB4789.3-2003使用的培养基是:乳糖胆盐发酵培养基,伊红美兰琼脂,乳糖发酵培养基。梁智安的研究发现新旧国标最明显的区别在培养基的变化上,虽然两者都是建立在乳糖发酵的基础上,但是乳糖胆盐培养基中抑菌剂为胆盐,抑菌效果差异明显。而月桂基硫酸盐能有效抑制非大肠菌群的生长,而且煌绿乳糖胆盐肉汤还能避免非乳糖的干扰和许多芽胞杆菌等杂菌的干扰,检测效果好。
3.2 稀释液对大肠菌群检测结果的影响。
稀释液虽然可以用灭菌生理盐水或用磷酸盐缓冲液,但是有研究表明磷酸盐缓冲液对细菌细胞有更好的保护作用,灵敏度更高。用七种不同的食品作为样品,分别用灭菌生理盐水和磷酸盐缓冲液作稀释液,按照GB4789.3-2010的检测步骤进行试验,得出的结果见表1。
以上数据表明,对于一般检样稀释液采用生理盐水和磷酸缓冲液测出的大肠菌群数据基本一致,而对于含盐量较高的食品(如咸肉、调味汁等)宜选用磷酸缓冲液为稀释液,灵敏度更高些。
3.3 PH 值对大肠菌群检测结果的影响
“GB4789.3-2010”规定大肠菌群检测所需使用的培养基PH值应该调至中性(PH7.0)左右。检测时所提出的PH值是指样品的有效酸度,即氢离子活度,中性溶液中PH为7,碱性溶液中PH＞7,酸性溶液中PH＜7。用生乳为样品,用不同量的盐酸溶液加入大肠菌群检测所需使用的培养中,调出不同PH值后,按照GB4789.3-2010的检测步骤进行试验,检验结果见表2。以上结果可以看出,随着PH值的减小,样液的大肠菌群越来越少,且与PH值呈正相关关系。尤其是PH值在2.00左右时,可以完全抑制大肠菌群的生长。
3.4 稀释至接种时间对大肠菌群检测结果的影响
日常工作时,经常由于每次检验样品的数量较多,为了工作方便,往往是把待测的所有样品取样、制备稀释匀液一起完成后,再进行接种、培养,但是稀释至接种间隔时间长短却对大肠菌群测定结果有影响。用街头的即食凉皮为样品,按照GB4789.3-2010的检测步骤进行试验,在不同稀释至接种时间下测定的结果见表3。以上数据显示,检样从稀释至接种时间间隔越长,测出的大肠菌群越多,影响结果的准确性。因此,从制备样品匀液到样品接种完毕,全过程不得超过15min。
3.5 培养时间对大肠菌群检测结果的影响
用标准大肠埃希氏菌接种于灭菌好的牛乳中作为样品,按照GB4789.3-2010的检测步骤进行试验,在不同培养时间下测定的产气情况见表4。
大肠菌群产气至少要在孵育14h之后才能见到。因此,应该严格按照“GB4789.3-2010”规定:样品稀释匀液接种于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤后,需置于(36±1)℃恒温培养箱中,培养(24±2)h,观察倒管内是否有气泡产生,(24±2)h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养(48±2)h,产气者进行复发酵试验。控制好培养时间,以防出现假阳性或假阴性的现象。
4、 讨论
综合以上分析,可以得出结论:食品中大肠菌群的测定过程中,需按照国标的要求,选用最佳的培养基(种类和PH值)、稀释液,操作过程准确紧凑,并严格控制培养条件(时间),以确保数据结果的可靠性,得出的检测结论更有说服力。
参考文献：
[1]李志明.食品卫生微生物学检验[M].北京:化学工业出版社,2009.
[2]中华人民共和国卫生部-中华人民共和国国家标准GB478913-2010,食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[S].中国标准出版社,20lO.
[3]梁智安.食品中大肠菌群检测的新旧国标方法差异探讨[J].食品与生物,2011(06):21-22.
