前言
黑素瘤作为一种起源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统色素沉积区域的黑色素细胞的高度恶性肿瘤，是一种由异常黑色素细胞过度增生引发的常见皮肤恶性肿瘤，是皮肤癌的前期症状[1-3].在所有的皮肤恶性肿瘤中黑素瘤的发病率居第三位，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，近年来国内外发病率呈不断上升趋势。目前治疗黑素瘤的主要方法是是外科手术切除和放化疗，然而手术创伤大，局部广泛切除后还需再进行植皮手术，放化疗则副反应大，在杀灭肿瘤细胞的同时也杀灭了正常细胞。
近年来，低温等离子体 （Low Temperature Plasma, LTP）在生物医学领域的应用越来越广泛，主要集中在废液废气、医疗器械、食品等的消毒灭菌和改善医用生物材料的生物相容性等方面，已取得了显着的成效，被国内外大量研究所证实[4].同时，LTP 也逐步开始应用于对人和动物活细胞的处理，人们尝试着使用 LTP 来取代或者辅助传统的医疗手段和医疗器械，已初步取得了一些令人满意的成果[5].
但传统的 LTP 源因产生的等离子体位于两个电极之间或放电效率和活性粒子浓度较低，无法作用于实际人或动物身上的活体细胞或处理效率十分低。因此研究者们利用气流和电场的共同作用开发了一种新颖的 LTP 产生方法，即大气压等离子体射流 （Atmospheric Pressure Plasma Jet, APPJ），将放电区域所产生的等离子体从射流管口喷出。相比于传统的 LTP 产生方法，APPJ 具有无需密封系统、放电区域与工作区域分离、活性粒子可随气流而作用于对象表面、便于调控和处理三维复杂曲面结构的对象等优点，已逐步被人们应用于生物医学领域、材料表面改性、表面刻蚀、薄膜制备等领域，表现出独特的技术优势和良好的应用前景[6-8].由于APPJ 可精确定位于肿瘤组织，从而避免对正常细胞和组织的破坏，具有创伤小和副反应小的优点。因此如可采用 APPJ等手段，来代替手术切除、化疗等常用医疗手段或医疗器械，不仅可以减轻药物所带来的副作用和化疗手段所带来的巨大疼痛，还可以达到经济有效治疗的目的。
本实验首先通过两种 APPJ 装置，将小鼠体外黑素瘤作为 APPJ 作用的研究对象，通过对等离子体参数与成分的诊断和作用前后黑素瘤细胞相关参数（存活数、细胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等）的检测，来考察和探索 APPJ 对黑素瘤细胞生长的抑制作用及相关机制。有望为 APPJ 治疗皮肤恶性肿瘤提供理论基础，并期望提出治疗恶性肿瘤可能的新方法，进而减少疾病的折磨，造福于社会。
1 大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究
1.1 实验方法
实验中选用小鼠黑素瘤细胞 （B16） 进行体外培养，所使用培养液为 RPMI-1640 细胞培养液（含 10% 小牛血清，100U/mL 青霉素与 0.1mg/L 链霉素），置于 37℃，5%CO2 孵育箱孵育，每三天更换一次培养液，次，待成纤维细胞长满瓶壁，用 0.25% 胰蛋白酶消化，并用 PBS 将细胞浓度调至1×106/mL.
培养完毕后将细胞从培养瓶壁上消化下，离心后加入培养液进行吹打，随后将含有细胞的培养液加入医用 96 孔板，因 96 孔板的孔径与石英管 APPJ 的大小差不多，因此我们选用了石英管 Ar APPJ 置于 96 孔板上方来处理小鼠黑素瘤细胞。实验在常气压下的超净工作台中进行。试验环境条件为：室温 20℃，相对湿度 60%.实验数据以 ±SD（均数 ± 标准差）形式表示，均数间的差异采用随机区组方差分析方法检验，采用 SPSS13.0 统计软件分析。
1.2 实验结果与分析
1.2.1 细胞存活能力、酪氨酸酶活性及黑色素含量的检测采用四唑盐比色实验来检测细胞的存活能力，所用的显色剂为噻唑蓝，简称为 MTT.在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比，用以检测等离子体是否对癌细胞总量有减少或抑制作用。黑色素合成能力的检测采用酪氨酸酶活性实验。黑色素含量则用于判断 APPJ 处理是否减少了黑素瘤细胞的合成黑色素量。以上三种方法在不同APPJ 处理时间下的检测结果均通过分光度来表示，如图 4所示。可见，以上三种检测实验的 OD 值均随着 APPJ 处理时间的增长而逐渐减小，意味着细胞存活能力、黑色素合成能力及黑色素含量快速下降，黑素瘤细胞的生长和活性得到了一定程度的抑制。当 APPJ 处理时间 4s 以上，相比于控制组，三种检测实验的 OD 值开始剧烈下降，差异有统计学意义（P<0.05）。【1】
1.2.2 电子透射电镜的观察利用电子透射电镜 （TEM） 观察 APPJ 处理前后黑素瘤细胞的形貌变化情况。具体步骤如下：将经 APPJ 处理后的悬浊液，在 3000×g 下离心 10min,弃去上清液；沉淀由 PBS 清洗 3 次，每次 3000×g,5min;加入 2mL 戊二醇（2.5%）在 4°C下固定 24h,之后用 0.1M 的 PBS 浸洗 30min;加入 2.5% 的四氧化锇在 4°C 下固定 2h 后，用 0.1M 的 PBS 浸洗 10min,乙醇梯度脱水；环氧树脂 Epon812 浸透、包埋，聚合后利用超薄切片机（瑞典 LKB-V）进行超薄切片 50~70nm,作超薄切片；醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射式电子显微镜（日本日立H-600）下观察、拍照。如图 2 所示。可见，大部分细胞的细胞壁和细胞膜破裂，细胞内物质逸出；并且对比图 5（b） 和图5（d） 的细胞器图可见，经 APPJ 处理之后，细胞的线粒体、内质网大大减少，整个细胞器变得空旷。1.2.3 细胞凋亡率检测细胞凋亡是指细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。凋亡细胞数目越多，则说明等离子体处理对癌细胞生长有抑制作用，促进其细胞凋亡，有助于减缓癌细胞疯长，减轻患者症状。通过将细胞悬液离心、加入缓冲液后置于488nm 氩离子激光器检测，检测结果如表 1.可见，当 APPJ处理时间高于 4s 之后，黑素瘤细胞中凋亡细胞的百分比快速增大，6s 之后坏死细胞的百分比也快速增大，这说明 APPJ 只需处理 6s 以上就可杀灭绝大部分的黑素瘤细胞。【2】
1.3 APPJ 作用黑素瘤细胞的机理探讨
从实验结果和分析中可知，APPJ 可快速 （ 几 s 内 ） 杀死黑素瘤细胞，破坏细胞壁和膜，抑制黑素瘤细胞的生长，这表明这是 APPJ 中的某种物质可以破坏细胞壁和细胞膜，使得细胞壁和细胞膜破裂，线粒体和内质网大大减少，并使得细胞质从细胞中泄漏出来，抑制黑素瘤细胞的活性、合成能力与生长，使细胞趋于凋亡和坏死。
因 Ar APPJ 为低温等离子体，通过红外测温可知其温度约在室温范围，因此温度效应可以基本忽略。由图 3 可知，Ar APPJ 中包含的作用于生物细胞的活性成分包括紫外线、带电粒子（电子、阴阳离子如 N2+）以及活性氧和活性氮种（reactive oxygen and nitrogen species,RONS,比如 OH 自由基、原子态氧、激发的 N2 和 O3）。由于在大气压下的 APPJ中，紫外线可被等离子体和周围空气吸收，不能到达被处理的样品表面，所以紫外线的作用在 APPJ 对生物细胞的处理过程中也可以忽略。因此，国内外多数研究者认为 RONS 在大气压 LTP 对生物细胞的处理过程中发挥主要作用[9,10].在APPJ 中，RONS 可以到达被处理的细胞样品表面，因此我们同样基本认为 RONS 对黑素瘤细胞作用效果最大。在细胞信号转导级联、蛋白泛素化及降解、细胞骨架以及细胞周期调控蛋白等系统都参与 RONS 的细胞周期调控作用。RONS的增加激活了 p21Cip1的表达并导致细胞周期 G1期阻滞，这种 G1期细胞周期阻滞最终导致了细胞凋亡。
2 结论
利用所开发的两种 Ar APPJ 装置，结合等离子体参数与成分的诊断，以及作用前后黑素瘤细胞相关参数（存活数、细胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等）的检测，研究了APPJ 对小鼠黑素瘤细胞 （B16） 的抑制作用及相关机制。得到了如下结论：
两种 Ar APPJ 应用安全可靠，且富含 OH 自由基；APPJ处理可破坏黑素瘤细胞壁和细胞膜，大大减少细胞的线粒体和内质网，抑制黑素瘤细胞的生长和活性，使细胞趋于凋亡和坏死，探讨认为 APPJ 中的 RONS 发挥了主要的抑制作用；
参考文献
[1] 廖怀伟 , 刘丽忠 , 文辉才 . 皮肤黑色素瘤的治疗新进展 [J]. 中华实验外科杂志 , 28（11）： 2020-2021, 2011.
[2] 韩睿 , 程浩 , 朱可建 . 恶性黑素瘤 38 例临床分析 [J]. 中国皮肤性病学杂志 , 28（7）： 477-478, 2007.
[3] 朱健伟 , 骆丹 . 黑素瘤细胞粘附与迁移相关表面分子研究进展 [J].肿瘤基础与临床 , 19（6）： 531-534, 2006.
[4] Kedzierski J, Engemann J, Teschke M, et al. Atmospheric pressureplasma jets for 2D and 3D materials processing[J]. Solid StatePhenomena, 2005, 107: 119-124.
[5] 邹菲 . 大气压射流等离子体对癌细胞的作用及机制研究 [D]. 华中科技大学 , 2011.
