疲痕疙瘩(KeloidsOMIMNo.148100)是皮肤损伤后引发的胶原异常积累所致的过度疲痕化，是人类特有的一种病理愈介现象。疲痕疙瘩是皮肤科和整形外科领域的常见病，多发病。疲痕疙瘩可发生于所有人群，流行病学调查表明，有色人种如黑种人和黄种人疲痕疙瘩的发生率明显高于自种人，黑人发病率约为自人的5-15倍，黑种人、欧洲自种人、亚洲黄种人发病率在4.5%一16%最高可接近20%。山于病因小明，发病机制复杂及种族和个体差异，目前尚无十分有效的根治方案[f21。该病好发于胸骨区，亦可见于肩部，而部，颈部和耳部等处，病程慢性迁延，严重影响患者的容貌，形象及自我评价，进而在很大程度上影响患者的心理健康。同时继发于烧伤，烫伤者可形成大而积损害，严重者可影响受累肢体功能，给患者身心健康带来严重影响，给家庭和社会带来沉重的负担疲痕疙瘩的病因复杂，其发病机制尚未完全阐明，目前普遍认为该病是一种多基因或基因与环境因素共同作用的一种复杂性疾病。大量研究表明遗传因素与疾病发病密切相关。其中免疫遗传因素在疲痕疙瘩的发病中起着重要作用。因此，寻找疲痕疙瘩免疫遗传相关易感基因并探讨其功能是从根本上揭示疾病病因和发病机制的重要途径，对今后疾病的预防和治疗方案的改进具有重要意义，同时也可能揭示基底成纤维细胞异常增殖的分子遗传学机制，从而有助于其他疲痕性疾病的研究。近年来人们对免疫遗传研究主要集中在人类主要组织相容性抗原复介体(majorhistocompatibilitycomplexMHC)，然而，至今与疲痕疙瘩相关的MHC区域易感基因未能被真正确认。本实验应用聚介酶链反应一序列特异性引物(PCR-SSP)技术观察疲痕疙瘩及其小同表型与HLA单倍体的相关性，为进一步探讨免疫遗传学因素在疲痕疙瘩的发病机理中的作用提供理论依据。
一、资料与方法
1.检测对象:疲痕疙瘩组为2010年8月至2012年12月女徽省立医院、女徽六女市人民医院、徐州医学院附属医院、无锡二院门诊就诊的疲痕疙瘩患者，均符介疲痕疙瘩的诊断标准。肥厚性疲痕和其他伴有疲痕疙瘩的综介征患者均被排除在外。研究人群包括91例男性患者和101例女性患者，年龄79岁，平均31.54岁;每例患者均填写知情同意书。对照组为同期在门诊就诊的非疲痕疙瘩患者或外科住院患者的健康家属，无血缘关系，共收集血标本252份，年龄5^'70岁，平均<32.40士10.05)岁，其中男124例，女128例。两组性别、年龄构成均无统计学差异。本研究采用统一设计的疲痕疙瘩流行病学调查表，山经过专业培训的调查员以相同的态度对先证者及正常对照进行问卷调查。调查表内容包括一般情况(姓名、年龄、性别、住址、电话、文化程度和婚姻状况等)，发病年龄，疾病病程，发病部位，皮损形状、数目和而积，皮损特点及严重程度评分。选用疲痕疙瘩的颜色(正常、淡红和赤红)、高度(平坦、1-4mm.5-8mm和8mm以上)、质地(正常、稍软、硬如橡皮和硬如软骨)、是否瘤痒(无、偶尔、时常和居」烈)和疼痛(无、有时、经常和剧烈)作为病情轻重程度的指标。每项指标根据临床表现赋子0-3分，分数越高代表病情越重。综介评分为0-15分，再将其分为0-5分(轻度)、6-10分(中度)和11一15分(重度)三组。记录每位患者疲痕疙瘩的数量和发生部位。
2.血标本收集:每例受检者收集2ml，全血放入含构椽酸钠的试管内，2000r/min离心10min取出其中的自细胞，置于2ml离心管内，放人一85℃冰箱保存。
3.基因组DNA制备:采用改良盐析法从分离的细胞中提取基因组DNA，用紫外分光光度计测DNA原液吸光度，算出DNA原液浓度，用灭菌双蒸馏水将DNA模板配制成质量浓度为50ng/闪的使用液，置于一20℃冰箱保存。
4.等价菜因序列特异性引物:按u献介成序列特异性引物及内对照引物。利用PCR-SSP法分析HLA-A.B.Cw.DQA1.DQB1.DRB1各座位等位基因及单倍型的分布情况。另外介成2条内参照引物，用于扩增HLA-DRB1基因第3内含子796by片段的保守序列。所有引物均山上海生工生物工程技术服务有限公司介成。
5.PCR反应及产物检测:每个反应总体积10闪，双蒸水，内参照引物(2.0}mol/L)1.0}1}1.25nmol/LdNTP1.0}1(上海生工生物工程技术服务有限公司)10倍缓冲液(含25mmol/LMgC12)1.0等位基因特异性引物(10mmol/1}P3',等位基因特异引物(10mmol/1}PS')0.5 Taq酶<5U单l0.1}1，待测基因组(50ng单1)3.0。采用Touch-DownPCR程序1:94℃变性5min，94℃变性45s，退火温度从70℃开始，每个循环下降0.5℃，退火时间45s,72℃延伸45s，共30个循环，720C延伸5minxPCR反应在T-GradientPCR仪(德国Biometra公司)上进行。将PCR产物力II2}1澳酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶(内含0.5fig/澳化乙陡)上进行，在AAB紫外线透射凝胶成像仪系统(AdvancedAmericanBiotechnology公司产品)观察结果。
6.数据处理:等位基因频率(AFB、连锁小平衡CLD即△)、单倍型频率(Pna}、连锁小平衡值C4AB)的计算见文献fizl。采用InfoEpi6.SPSS软件对疲痕疙瘩患者及正常人对照，小同严重度、发病是否有家族史及正常人对照间进行等位基因频率比较。比较采用扩检验，以P0.05为差异具有统计学意义。
二、结果
HAL-I、II类等位基因间的两点单倍型连锁小平衡分析，10个二位点单倍型与疲痕疙瘩发病呈正相关结果见表1。以上基因间的连锁均有统计学意义(P0.05。携带A*25-B*07<x2=3.36,P}0.05)和B*07-DRB1*15<x2=17.82,P}0.05)单倍型的疲痕疙瘩患者更多表现为有阳性家族;携带HLA-A*25-B*07<x2=4.03，P}0.05)，B*07-DRB1*15(扩=5.53，P}0.05)和DQA1*0104-DQB1*0503(扩=20.66,P}0.05单倍型的疲痕疙瘩患者更多的表现中等严重度。表明小同类型的疲痕疙瘩患者可能有小同的遗传基础(表2-6)。
三、讨论
目前已有越来越多的证据表明疲痕疙瘩是一种遗传性疾病。首先，疲痕疙瘩更加容易出现在肤色较深的民族;其次，家族遗传性和双胞胎中的高发病率也显示疲痕疙瘩具有遗传性。疲痕疙瘩的遗传学研究多集中在疲痕疙瘩相关基因的表达水平上，其中较多的集中在疲痕疙瘩与P53基因、FAS基因·c-myc,c-fos,ras基因、Bcl-2家族、ICE家族等各种凋亡基因以及细胞因子TGF-p、IL等相关性研究its-t但也只是停留在探索性研究阶段，迄今为比尚未有统一的定论。近年来，免疫遗传因素在异常疲痕形成的重要性越来越受到重视。一些研究已经表明免疫遗传因素在增生性疲痕和疲痕疙瘩的发病机制起到一定的作用。Santucci等在对增生性疲痕和疲痕疙瘩调查研究中发现疲痕疙瘩皮损组织有大量的免疫细胞浸润，其中包括CD3-,CD45R0一和CD4-T淋巴细胞。目前免疫遗传研究热点主要集中在主要组织相容性复介体(MHC，即作为已知的人类自细胞抗原(HLA)系统。人类主要组织相容性复介体(majorhistocompatibilitycomplexMHC)编码的基因是位于人类第6对染色体短臂上紧密连锁的基因群。此区域是人类基因组中基因密度极高的区域之一，是免疫功能相关基因中最集中、最多的一个区域，是迄今所知人类基因多态性最丰富的一个区域，是与疾病关联最为密切的一个区域。早在1977年Laurentaci和Dioguardi等首次报道了HLA-B14和B16抗原与疲痕疙瘩发病显著相关，此后，国内外一些学者陆续对HLA等位基因与疲痕疙瘩的相关性进行研究，小断发现了和疲痕疙瘩及其小同临床表型的相关性位点，然而国内对疲痕疙瘩的遗传学研究较少。HLA复介体是一组紧密连锁的基因群。这些连锁在一条染色体上的等位基因很少发生同源染色体间的交换，构成单倍型。在遗传过程中，HLA单倍型作为一个完整的遗传单位山亲代遗传给子代。HLA系统最突出的一个特点是某些HLA等位基因在一起的频率比预期的机会更多。如果单倍型频率比预期的随机重组率高，说明两个基因座存在着连锁小平衡。
某些疾病的易感基因可能小是单一的等位基因，而可能是多个等位基因组成的基因群，检测扩展单倍型可以在寻找某些疾病基因方而提供更有价值的信息。我们可以通过家系或群体资料估计出单倍型和基因的频率。本研究通过对HLA-A.B.C.DQA1.DQB1.DRB1构建的单倍型，经过病例对照研究，发现10个有阳性意义的单倍型，包括A*03-B*07.A*03-Cw*0802.A*25-B*07、A*25-Cw*0802、B*07-Cw*0802、B*07-DQB10501.B*07-DRB1*15.DQA1*0104-DQB1*0501、DQA1*0104-DQB1*0503.DQB1*0503-DRB1*15与疲痕疙瘩呈正相关，携带这些单倍型的人群疲痕疙瘩易感性明显升高。
以们的报道中未见有关单倍型与疲痕疙瘩小同临床表型之间相关性的报道，本研究通过分层分析发现，小同临床表型与HLA单倍型的相关性小同。通过HLA单倍型与疲痕疙瘩小同严重程度的相关性分析，未发现只与严重型疲痕疙瘩有相关性的单倍型，而发现3个单倍型HLA-A*25-B*07,B*07-DRB1*15,DQA1*0104-DQB1*0503与疲痕疙瘩的中等程度有相关性，说明携带该单倍型的患者易患中等程度疲痕疙瘩。可能原因有待进一步探讨。疲痕疙瘩的发生存在着家族聚集现象，通过HLA单倍型与疲痕疙瘩阳性家族史的相关性分析，显示了A*25-B*07和B*07-DRB1*15单倍型与有阳性家族史的患者呈正相关性。B*07-DQB1*0501与散发患者有相关性。以上结果表明，家族史阳性的疲痕疙瘩病患者与散发患者可能存在小同易感基因。
疲痕疙瘩与HLA的关系密切，疲痕疙瘩的易感基因可能位于HLA基因区内或者与HLA基因相连锁。疲痕疙瘩的易感基因可能是多个等位基因组成的基因群，检测扩展单倍型可以在寻找某些疾病基因方而提供更有价值的信息，尤其在疲痕疙瘩家系中进行HLA扩展单倍型的研究将会得到史大的启示。
总之，对疲痕疙瘩MHC区域易感基因发病机制的探讨，小仅能为临床医生诊治这种疾病提供指导，而且对于遗传咨询及风险预测及药物开发具有重要意义。
