连作障碍是指在同一块田地连续种植同一种（科）作物导致产量降低、品质变劣、土壤物质生产性能变差的现象[1-2].早在公元前 300 年， 人们就已经发现了连作障碍， 但由于传统农业的轮作倒茬与精耕细作， 因此并未造成严重损失.进入现代农业，长期连作引发的作物大面积减产、土传病害发生等在全国各地普遍存在。如黑龙江东北部大豆（Glycinemax）重迎茬面积已达 70%以上, 与正茬相比引起的减产幅度可达 10%~40%.水稻（Oryza sative）、辣椒（Capsicum annuum）、西瓜（Citrullus vulgaris）等长期种植也会引发土传病害加剧， 导致作物产量显著下降[6-8].连作障碍是土壤-植物-微生物等诸因素综合作用的结果， 与土壤微生物区系失衡、植物营养吸收差异性及根系次生代谢化感物质等密切相关[9-11].谷岩等研究发现大豆长期连作的土壤脲酶和转化酶活性降低， 真菌和细菌磷脂脂肪酸分析（PLFAs）比例显著增加。马铃薯（Solanum tuberosum）连作则增加了镰刀菌（Fusarium spp.）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的种群或个体数量， 这些真菌是导致马铃薯土传病害的主要致病菌类型（试验结果未发表）。王志刚等研究表明， 根际土壤过氧化氢酶与多酚氧化酶活性随韭菜（Allium tuberosum）连作年限的增加而降低。可见， 长期连作明显影响了土壤微生物种群数量与群落结构， 导致病原微生物扩增并造成病害型连作障碍。保持农田土壤微生物群落多样性对提高土壤生物活性、减轻土传病害具有重要意义。
作为农业支柱产业， 棉花（Gossypium hirsutum）种植面积占新疆作物总面积的 50%~70%, 有些地区甚至达到 90%.多年连作导致棉花枯、黄萎病加剧， 严重威胁新疆棉花可持续生产。前人对新疆棉花枯萎病（Fusarium oxysporium spp.）、黄萎病病菌（Verticillium dahliae）的研究主要集中在致病菌的分离鉴定、可培养菌系的数量动态变化等方面， 从农田土壤致病菌与拮抗菌多样性角度， 研究长期连作对滴灌棉田土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构的影响鲜有报道。
本试验在北疆石河子莫索湾垦区选取 5 年、10年和 15 年连作棉田典型样地， 通过酶学和微生物分子生态学技术对长期连作棉田土壤酶活性、致病菌与拮抗菌群落结构多样性进行了研究， 试图揭示土壤酶活性与致病菌、拮抗菌群落多样性对北疆棉区棉花长期连作的响应， 为构建健康土壤微生物区系及棉田土传病害防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验设置
试验区基本情况： 新疆第八师莫索湾垦区147团（44°54′~44°69′N, 85°98′~86°13′E）， 位于天山北麓准葛尔盆地南缘玛纳斯河中游冲积平原， 属绿洲灌溉农业区。年均≥10 ℃积温为3 600~3 750 ℃ ,年降水量为158.5~172.4 mm, 无霜期155~178 d.供试土壤属灌耕灰漠土（灌淤旱耕人为土， calcaric fluvisals），pH 8.03, 有机质10.42 g·kg-1, 土壤矿质氮57.63 mg·kg-1,有效磷10.27 mg·kg-1, 有效钾379 mg·kg-1.试验选取不同种植年限的棉田（147团21连）， 分别为5年棉花连作（CtN5）， 样地面积0.5 hm2; 10年棉花连作（CtN10）， 样地面积1 hm2; 15年棉花连作（CtN15）， 样地面积3 hm2.
1.2 样品采集
采用多点混合法以“S”型路线在样地上采集0~20 cm耕层土壤， 在样点附近取12钻为1个混合样， 共3个混合样。土样采集后， 一部分存放在4 ℃冰箱， 用于测定酶活性； 另一部分存放在-80 ℃冰箱， 用于土壤DNA提取和后续PCR-DGGE分子生物学指标测定。
1.3 土壤酶活性测定
土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定（5 g土， 0.5 h）， 结果以1 g土壤在30 min消耗的高锰酸钾的毫升数表示[15].蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法（5 g土， 37 ℃ , 24 h），显色强度在分光光度计508 nm波长测定， 酶活性用24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克数表示[15].芳基硫酸酯酶采用对硝基苯硫酸钾比色法（5 g土， 37 ℃ , l h），显色强度通过分光光度计410 nm波长测定， 结果以每小时1 g土壤中释放出的对硝基苯酚微克数表示[16].脱氢酶采用TTC比色法（6 g土， 37 ℃ , 24 h），显色强度通过分光光度计485 nm波长测定， 结果以每小时1 g土壤中释放出三苯基甲臜（TPF）的微克数表示[17].蛋白酶采用以酪蛋白做底物的方法（2.5 g土， 50 ℃ , 2 h），显色强度通过分光光度计700 nm波长测定， 结果以2 h后1 g土壤中酪氨酸的微克数表示[17].
1.4 土壤 DNA 及微生物群落结构与多样性测定土壤总 DNA 的提取采用 PowerSoilTMDNAIsolation Kit（MO BIO Laboratories Inc.USA）。试验所用引物和 Taq 酶试剂盒均由大连宝生公司生产。
1.4.1 细菌 16S rDNA V6 区 PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）。细菌 16S rDNA V6区 PCR扩增采用通用引物对F968-R1401, 引物序列见表 1.PCR 扩增条件为：94 ℃变性 5 min, 接着 20 个循环（94 ℃变性 1 min,67 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 每个循环退火温度降 0.5 ℃ ），然后 15 个循环（94 ℃变性 1 min, 57 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 每个循环退火温度降0.5 ℃） ,最后再 72 ℃延伸 10 min.产物片段长度 450 bp.土壤中总细菌（16S rDNA）PCR 产物进行 DGGE 分离时， 使用 7%的胶， 变性浓度 45%~55%, 缓冲液为 1?TAE 溶液， 电泳条件： 电压 110 V, 温度 60 ℃， 时间 17 h.
1.4.2 真菌 ITS 18S rDNA PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）。真菌 ITS 18S rDNA PCR 扩增采用通用引物对ITS1F-ITS2, 引物序列见表 1.PCR 扩增条件为：94 ℃变性 5 min, 接着 36 个循环（94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min）， 最后再 72 ℃延伸10 min.产物片段长度 300 bp.土壤中真菌（ITS 区）PCR产物进行 DGGE 分离时， 使用 8%的胶， 变性浓度30%~50%, 缓冲液为 1?TAE 溶液， 电泳条件： 电压110 V, 温度 60 ℃ ,时间 17 h.
1.4.3 镰刀菌 Nest PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）Fusarium Nest rDNA PCR 扩增采用通用引物对EF 1-EF 2 和 Alfie1F-GC-Alfie2R, 引物序列见表 1.
第 1 轮反应中， 每 25 μL 反应体系含有1 μL 10 mmol·L-1EF 1 溶液， 1 μL 10 mmol·L-1EF 2 溶液， 2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq PlusDNA Polymerase（上述所有药品均购自大连宝生公司）， 3 μL 土壤总 DNA 溶液， 再加无菌去离子水至25 μL.PCR 扩增条件为： 94 ℃变性 5 min, 接着 43 个循环（95 ℃变性 45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s），最后再72 ℃延伸10 min.第1轮产物片段长度1 000 bp,此处并非只有 1 条很显著的特异性条带， 而是有很多条非特异性条带， 并不影响第 2 轮扩增。第 2 轮反应中， 每 25 μL 反应体系中， 含有 1 μL 10 mmol·L-1Alfie1F-GC 溶液， 1 μL 10 mmol·L-1Alfie2R 溶液，2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有药品均购自大连宝生公司）， 3 μL 第 1 轮 PCR 产物后的 DNA溶液， 再加无菌去离子水至 25 μL.PCR 扩增条件为：94 ℃变性 3 min, 接着 30 个循环（92 ℃变性 30 s, 55 ℃退火1 min, 68 ℃延伸45 s）， 最后再68 ℃延伸15 min.
第 2 轮产物片段长度 500 bp.进行 PCR-DGGE 电泳条件： 使用 6%的胶， 变性浓度 40%~60%, 缓冲液为1×TAE 溶液， 电压 110 V, 温度 60 ℃ ,时间 17 h.1.4.4 枯草芽孢杆菌 Nest PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳（DGGE）Bacillus Nest rDNA PCR 扩增采用通用引物对BACF-R1378 和 F968-R1378, 引物序列见表 1.第 1轮反应中， 每 25 μL 反应体系含有 1.5 μL 10 mmol·L-1BACF 溶液， 1.5 μL 10 mmol·L-1R1378 溶液， 2 μL2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,0.25 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有药品均购自大连宝生公司）， 2 μL 土壤总 DNA 溶液， 再加无菌去离子水至 25 μL.PCR 扩增条件为： 94 ℃变性5 min, 接着 2 个循环（94 ℃变性 1 min, 63 ℃退火1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 然后再 2 个循环（94 ℃变性1 min, 61 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 随后再 2个循环（94 ℃变性 1 min, 59 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸2 min）， 紧接着再 2 个循环（94 ℃变性 1 min, 57 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 之后再 22 个循环（94 ℃变性 1 min, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 最后再 68 ℃延伸 15 min.产物片段长度 1 300 bp.
第 2 轮反应中， 每 25 μL 反应体系中， 含有 1.25 μL10 mmol·L-1F968-GC 溶液， 1.25 μL 10 mmol·L-1R1378 溶液， 2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有药品均购自大连宝生公司）， 3 μL 第 1 轮 PCR产物稀释 2 万倍后的 DNA 溶液， 再加无菌去离子水至 25 μL.PCR 扩增条件为： 94 ℃变性 3 min, 接着30 个循环（92 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 45 s）， 最后再 68 ℃延伸 15 min.产物片段长度410 bp.进行 PCR-DGGE 电泳条件： 使用 7%的胶，变性浓度 50%~65%, 缓冲液为 1×TAE 溶液， 电压110 V, 温度 60 ℃ ,时间 17 h.
以上 PCR 扩增片段均经 1.5%琼脂糖进行目标基因检测， DGGE 使用 SYBR? Gold nucleic acid gelstain（USA）染色 20 min.
1.5 数据处理DGGE指纹图谱分析借助于Photoshop7.0进行图片调整， Gel-QuantTM1.0软件（Multiplexed Biotechno-logies Inc, USA）进行条带判读、迁移率、强度、面积计算， 采用UPGMA（unweighted pair group methodusing arithmetic average）方法进行聚类分析， 再根据 Primer 6.0 软 件 （Plymouth, United Kingdom） 对DGGE指纹图谱进行PCA分析。根据条带的相对位置和相对强度计算Shannon-Wiener 指数（H）和Simpson均匀度指数（E）来评价微生物的多样性[22].
式中： Pi为第 i 个物种在全部样品中的比例（Pi=ni/N,ni为第 i 个物种的个体数， N 表示每个样品中检测到的条带数）， S 表示 DGGE 检测到的每一泳道的条带总数即种的数目。数据分析采用 Excel 2010 和 SPSS17.0 统计分析软件进行处理， 处理间的差异显著性采用 Duncan 法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 棉花连作对土壤酶活性的影响
过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶及蛋白酶反映土壤生物活性与代谢功能[7,12].由表 2可知， 长期连作对棉田土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶活性均有明显影响。过氧化氢酶活性在 CtN5 处理最高， CtN15 处理最低。蔗糖酶活性在各处理间表现为： CtN5>CtN10>CtN15.
CtN10 和 CtN15 处理的脱氢酶活性较 CtN5 处理分别降低 42.6%和 49.5%（P<0.05）。随着棉花连作年限的增加， CtN5 处理的过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢酶活性分别比 CtN15 处理高 20.2%、141.3%、97.9%（P<0.05）， CtN15 处理的过氧化氢酶、蔗糖酶和脱氢酶活性分别比CtN10处理下降15.0%、6.4%和12.0%,比 CtN5 处理下降 16.8%、58.6% 和 49.5% （P<0.05）。芳基硫酸酯酶、蛋白酶在棉花连作 5~15 年中先降低后升高。总体上， 过氧化氢酶、蔗糖酶、脱氢酶活性随连作年限而降低， 芳基硫酸酯酶与蛋白酶活性变化呈先下降后升高的特点， 说明绿洲棉田长期连作使部分土壤酶活性下降。
2.2 棉花连作对土壤微生物群落结构的影响
2.2.1 棉花连作对土壤细菌、真菌群落结构的影响
细菌和真菌是土壤中两类最主要的微生物类群。聚类分析（UPGMA）结果表明， 在相似度为 75%情况下， CtN15 与 CtN5 各自聚为一类， 而 CtN10 与CtN5 的细菌群落多样性相似度较为接近（图 1A）。主成分分析（PCA）结果显示， 土壤细菌群落的 2个主成分轴 PC1 和 PC2 分别代表总变量的 33.8%和 21.2%,累计方差贡献率为 55.0%（图 1B）。在第 1 主成分轴能把 CtN15 与 CtN5、CtN10 相区分， 而第 2 主成分轴区别不明显。说明绿洲棉田连作不同年限改变了土壤细菌群落结构。真菌 DGGE 指纹图谱聚类分析（UPGMA）表明， 不同处理可聚为两类： CtN15单独聚为一类， CtN5 与 CtN10 聚为一类， 两类之间的相似度为 70%（图 1C）。由图 1D PCA 分析可知， 土壤真菌第 1 主成分（PC1）贡献率是 31.7%, 第 2 主成分（PC2）贡献率是 21.2%, 累计方差贡献率为 52.9%.
在第 1主成分轴上， CtN15明显区别于其他 2个处理；在第 2 主成分轴上， CtN10 有别于 CtN5 与 CtN15.聚类分析与 PCA 分析结果均表明， 新疆绿洲地区棉花长期连作对土壤真菌群落结构有明显影响。
2.2.2 棉花连作对土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构的影响
镰刀菌是一类导致棉田发生病害的典型土传病原微生物， 可引起棉花枯萎病。枯草芽孢杆菌能产生多种微生物酶和抗菌物质， 常被用作生防菌， 对土传病害具有显著的拮抗作用。图 2A、B 分别为土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌的 DGGE 指纹图谱。由DGGE 指纹印迹可知， 不同泳道条带数越多说明微生物群落多样性越丰富， 亮度越大密度越高， 说明群落中某一种群的数量越多。对不同连作年限土壤镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构 DGGE 指纹图谱进行主成分（PCA）分析， 结果表明在相似度为 37%情况下， 土壤镰刀菌的主成分（PC1 20.2%与 PC2 18.3%）可解释总方差变异的 38.5%; 在相似度为 58%情况下， 土壤枯草芽孢杆菌的主成分（PC1 41.6%与 PC220.1%）可代表总方差变异的 61.7%.由图 2C 可知，土壤镰刀菌 3 个处理主要分成两类， 在第 1 主成分轴 CtN10 显著区别于 CtN5 和 CtN15, 在第 2 主成分轴上方差分异不明显。土壤枯草芽孢杆菌变化趋势与镰刀菌相似， 但枯草芽孢杆菌对 3 种处理的响应更为敏感（图 2D）。说明新疆绿洲棉田连作 5~15 年，土壤中病原菌、拮抗菌群落结构均发生明显变化。
2.3 棉花连作对土壤微生物群落结构多样性的影响
土壤微生物多样性指数反映了群落中物种的丰富度及各种群间的均匀度分布状况， 多样性指数的高低表征微生物群落的复杂度和稳定性大小。由表3 可知， 细菌与真菌的条带数、多样性指数（Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数）均随连作年限的增加而下降。15 年棉花连作真菌的条带数和 Shannon-Wiener 多样性指数分别比 5 年棉花连作处理低17.02%和 5.29%.土壤镰刀菌与枯草芽孢杆菌的条带数、多样性指数随棉花连作年限的增加表现出先下降后升高的特点。土壤枯草芽孢杆菌的条带数、Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数表现为 CtN15处理分别比 CtN10 处理高 159.1%、54.8%、14.5%.
表明新疆绿洲棉田长期连作致使土壤主要微生物菌群多样性发生变化。
3 讨论与结论
长期连作使土壤有益菌种群结构随连作年限降低， 病原菌种群结构则随连作年限增加， 导致土壤微生物群落结构多样性失衡。胡元森等发现作为拮抗菌的木霉（Trichoderma spp.）数量随黄瓜（Cucumissativus）连作急剧下降 , 成为劣势菌群 , 而镰孢菌（Fusarium oxysporium）数量急剧上升为优势菌群。谷岩等报道大豆连作真菌和细菌 PLFAs 比例显著增加， 重迎茬使土壤活体微生物总量、土壤微生物量碳含量显著降低， 说明大豆连作改变了土壤微生物群落结构。在本试验中， 棉花连作 5~15 年使土壤细菌、真菌群落结构发生了明显变化， 多样性指数呈下降趋势。究其原因可能是北疆棉花长期连作加之秸秆还田， 棉花根系分泌的某些化感物质抑制了细菌、真菌中某些种群的生物活性， 导致其多样性水平降低。刘建国等对棉花不同连作与秸秆还田年限分析表明， 秸秆分解产生的化感物质所引起的自毒作用影响了土壤微生物的区系变化， 这为本文的推论提供了间接证据。
研究表明， 马铃薯根际镰刀菌数量随连作年限呈上升趋势， 但不同菌种数量变化的趋势各异.
Zhou 等研究发现， 长期连作黄瓜根际土壤尖孢镰刀菌数量呈先降低后升高又降低的变化趋势。本研究中棉田镰刀菌多样性先降低后升高， 之后并无再次降低的变化， 棉花连作 15 年镰刀菌和枯草芽孢杆菌群落结构多样性上升到一个新的水平， 并未导致棉田土壤微生物多样性的持续下降。Berendsen 等认为土壤微生物在长期协同演化过程中， 致病菌占优势的农田土壤能够自主富集一种或多种对致病菌具有抑制作用的微生物， 长期连作不仅可为病原微生物的增殖提供充分的时间， 又为病原菌与拮抗菌提供协同演化的生活环境。联系到新疆绿洲长期连作棉田， 可做如下推论， 即长期连作棉田的病原微生物种群数量与多样性发展变化到一定程度后会引起其他微生物群落（拮抗菌）能够自发调整其结构以适应外部环境， 这是土壤微生态系统中微生物群落结构的自组织和抗扰动作用的结果。Kinkel 等也提出土传病害的病原菌与其他微生物及其土壤环境之间存在密切的协同演化。生物对环境中能量的获取和利用机制， 尤其是针对不同物种 MEQ（microbiological energy quantum）的确立， 是生物与环境协同演化的结果.从微生物生态学原理分析，虽然土壤微生物种群数量及其多样性对外界各种扰动具有自我调节能力， 但在自然条件下， 其调节的水平与进程尚远未达到现代农业对作物低发病率和高产优质的要求。因此， 通过合理轮作或施用生物有机肥等是今后降低连作障碍， 构建“抑病型”健康土壤微生物区系的有效途径。
土壤中各种酶是土壤微生物功能多样性的承担者， 尤其是抗逆性酶与土壤拮抗（致病）菌数量存在极为密切的关系。如食荚菜豆根腐病（Aphanomyceseuteiches）的抗病性与芳基硫酸酯酶活性呈正相关，并且能够指示土壤真菌生物量.邢会琴等指出苜蓿（Medicago sativa）接种白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）后， 叶片过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均升高， 说明 POD 活性和 PAL 活性与苜蓿对白粉病的抗性显著相关。苏世鸣等运用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析土壤微生物多样性发现，西瓜单作的根际土壤中真菌数量较多， 细菌数量较少， 而且主要是革兰氏阳性菌； 单作西瓜的保护性酶类如根系及叶片中的多酚氧化酶（PPO）、CAT、POD 和 PAL 活性均较高。本文蛋白酶和芳基硫酸酯酶活性变化与土壤中镰刀菌、枯草芽孢杆菌对棉花长期连作的响应趋势一致。将土壤镰刀菌、枯草芽孢杆菌的条带数与蛋白酶、芳基硫酸酯酶及过氧化氢酶活性进行皮尔逊（Pearson）相关性分析后发现，镰刀菌的条带数与芳基硫酸酯酶活性呈显著正相关（r=0.79, P<0.05）； 与过氧化氢酶活性呈显著负相关（r=-0.71, P<0.05）。枯草芽孢杆菌的条带数与芳基硫酸酯酶活性、蛋白酶活性相关系数分别为 0.85、0.86,表现出显著正相关（P<0.01）； 与过氧化氢酶活性呈显著负相关（r=-0.76, P<0.05）。说明北疆绿洲 15 年棉花连作土壤致病菌、拮抗菌与土壤抗逆性酶活性呈现出显著相关关系。
综上所述， 15 年棉花连作对北疆土壤酶活性和土壤致病菌、拮抗菌群落结构多样性有明显影响。
土壤酶活性随连作年限增加而降低。细菌与真菌的多样性指数（Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数）在 5~15 年连作中呈下降趋势， 土壤镰刀菌与枯草芽孢杆菌的条带数、多样性指数表现出随棉花连作年限的增加呈先下降后升高的特点。长期连作对棉田土壤生物性状有明显负面影响。
