高效利用磷酸钙和卵磷脂功能的细菌菌株筛选

　　溶磷菌在转化土壤难溶磷、提高磷肥利用率、促进作物生长方面都具有显着作用,而不同溶磷菌对不同形态难溶磷的溶解能力存在差异。溶解难溶性磷酸盐的细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、节杆菌(Arthrobacter)、沙雷氏菌(Serratia)、肠杆菌(Enterobacter)和伯克霍尔德氏菌 (Burkholde-ria)等,溶磷量最高可达643.2mg/L;而溶解有机磷的细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus),溶磷量达到26.5mg/L。

　　溶磷菌溶磷机制各不相同,大部分溶磷菌以分泌物溶磷,其胞外分泌物中含有多种溶磷物质,近年来的研究主要集中在有机酸和磷酸酶方面。研究表明,大部分溶磷微生物的胞外分泌物中含有大量有机酸,所以一致认为有机酸是主要的溶磷物质;另外微生物生长繁殖过程中,分泌出酸性磷酸酶和碱性磷酸酶,这些磷酸酶能够不断地将环境中的有机磷转化为无机磷。蛋白质、多糖、氨基酸等物质在环境中可能会溶解难溶磷,这些物质可能也与溶磷菌的溶磷效果有关,但目前此方面研究较少。为此,本研究从生活垃圾堆积地采集土样,筛选兼具高效利用磷酸钙和卵磷脂功能的细菌菌株,并测定其在不同磷源培养下胞外分泌物中的有机酸、蛋白质、多糖、氨基酸含量及酸性磷酸酶活性,以期为高效溶磷菌的筛选及其溶磷机制研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 土样

　　供试土样取自生活垃圾堆积地非根际土壤。

　　1.2 难溶磷培养基

　　葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO41.0g、Ca3(PO4)25.0g或卵磷脂2.0g、无菌水1L,pH值7.0~7.5。

　　1.3 溶磷菌的筛选和溶磷能力的测定

　　将采集的土样用稀释平板法涂布于难溶磷卵磷脂培养基上,30 ℃培养5d,挑选周围产生明显透明圈的单菌落划线纯化后保存于LB固体斜面培养基上。用灭过菌的牙签将筛选出的菌株分别点接在2种难溶磷固体培养基上,30 ℃培养5d,挑选在2种难溶磷固体平板上均能产生明显透明圈的单菌落,并测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)。挑选D/d或D值较大的菌株,按1%接种量分别接入2种难溶磷液体培养基中,摇床培养6d(30 ℃、150r/min)。发酵液经10 000r/min离心10min,用钼锑抗比色法测定上清中可溶性磷含量,选择溶磷量最大的菌株进行鉴定。

　　1.4 溶磷菌的鉴定

　　1.4.1 生理生化鉴定参照文献[12]对溶磷菌分别进行生长温度试验、接触酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、糖醇类发酵试验、厌氧生长试验。

　　1.4.2 16SrDNA分析采用DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取细菌基因组DNA,利 用16S rDNA通 用 引 物 (P1:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;P2:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应条件:95 ℃ 5min;30个循环(94℃1min,55℃1min,72℃2min);72℃10min。扩增产物经PCR产物纯化试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)回收,连接pSURE-T载体后测序。

　　利用Blast将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析,采用Mega 5.05软件以邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树。

　　1.5 溶磷菌胞外分泌物中溶磷物质含量及活性测定将活化好的菌株按1%接种量分别接种于以磷酸钙、卵磷脂、磷酸氢二钾(对照)为唯一磷源的液体培养基中,30℃振荡培养,分别于第2、4、6天取培养液以8 000r/min离心10min,每个处理设3个重复。分别利用酸碱滴定法、茚三酮显色法、蒽酮 法、DNS法及 考 马 斯 亮 蓝G250染 色法测定上清液中的有机酸、氨基酸、总糖、单糖及蛋白质含量,利用对硝基苯磷酸二钠法测定上清液中酸性磷酸酶的活性。

　　2 结果与分析

　　2.1 溶磷菌株的分离、筛选初筛出32个可以溶解卵磷脂的菌株。将这些菌株点接于2种难溶磷固体平板上,有10株菌株在平板上形成明显透明圈,说明这10株菌株都具有降解卵磷脂和磷酸钙的能力。其中,菌株LY4、LY8、LY12、LY25在卵磷脂培养基上的D/d值较大,均大于3.0;LY7、LY8、LY10、LY25在磷酸钙培养基上的D/d值较大,均大于2.0。

　　2.2 溶磷菌溶磷能力分析综合 考 虑D、D/d值,挑 选 菌 株LY4、LY7、LY8、LY10、LY12、L25进行液体摇瓶复筛试验,以确定不同菌株对不同难溶磷源的溶解能力。由表1可知,对于卵磷脂,LY4的溶磷量最大,达到28.2mg/L;LY8次之,为26.6mg/L。对于磷酸钙,LY8的溶磷量最大,达到647.8mg/L;LY10次之,为625.4mg/L。综合考虑对卵磷脂和磷酸钙的溶解能力,选择LY8菌株进行后续试验。【表1】

　　
　　2.3 菌株LY8的初步鉴定菌株LY8能在5~40℃条件下生长,接触酶和苯丙氨酸脱氨酶试验为阳性,能水解明胶、淀粉,V-P试验为阴性,能利用柠檬酸盐,可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖产酸,在糖类中生长不产气,厌氧环境下不能生长。

　　菌株LY8的16SrDNA序列长度为1 560bp,利用Blast进行序列比对发现,其与Bacillus ar-yabhattai(HF570067.1)、Bacillus megaterium(AB334764.1)和Bacillus subtilis(EU257453.1)的同源性均达到99%。将其中与菌株LY8相似性较高的9种菌构建系统发育树(图1)。根据系统发育树,结 合菌株 的形态和生理生化 特征,初步确定LY8为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
　　
　　2.4 菌株LY8胞外分泌物中的溶磷物质分析
　　
　　2.4.1 有机酸有机酸是一类酸性有机化合物,能够解离出游离的H+,H+与PO3-4结合形成可溶性H2PO-4和HPO2-4盐,同时有机酸根离子能够与Fe3+、Al3+、Ca2+结合从而释放无机磷。由图2可以看出,贫磷条件下发酵液中有机酸质量浓度远远大于 富磷条件,尤其是在 磷酸钙 条 件下,这 与伊鋆的研究结果一致。随培养时间的延长,有机酸质量浓度微弱增加。其中,以磷酸钙为磷源时,发酵液中有机酸质量浓度最大可达到34.3g/L;以卵磷脂为磷源时,发酵液中有机酸质量浓度有所下降,最大达到11.2g/L。说明有机酸是菌株LY8的溶磷物质,尤其是溶解磷酸钙的主要物质。
　　
　　2.4.2 酸性磷酸酶磷酸酶可水解有机磷化合物释放出无机磷。在贫磷条件下,酸性磷酸酶活性明显提高(图3)。其中,以卵磷脂为磷源时,发酵液中酸性磷酸酶活性最高达4 100mol/(g·h);而以磷酸钙为磷源时,发酵液中酸性磷酸酶活性稍有下降,最高为2 760mol/(g·h)。所以,酸性磷酸酶是菌株LY8的溶磷物质,尤其是溶解卵磷脂的主要物质。而钟传青等研究发现,与可溶性磷和无机难溶磷相比,P4和Y3菌株在溶解有机磷时,发酵液中磷酸酶活性较低,与本研究结果不一致。所以,酸性磷酸酶可能不是所有溶磷菌株溶解有机磷必须的物质。另外,由图3可知,酸性磷酸酶活性在LY8菌株培养2d后即达到最大,且随着培养时间的延长,其活性明显下降,这可能是因为酶的活性受培养温度等条件的影响,所以磷酸酶的酶解作用主要发生在溶磷菌溶磷初期。
　　
　　2.4.3 多糖由图4可知,3种磷源条件下,菌株LY8均可分泌一定数量的多糖,但以卵磷脂为磷源时,发酵液中多糖质量浓度明显高于其他2种磷源,最高 达 到160.0 mg/L,说 明 多 糖 可 能 也 是 菌 株LY8溶解卵磷脂的重要物质。
　　
　　2.4.4 蛋白质由图5可以看出,3种磷源条件下,菌株均可分泌一定数量的蛋白质,且随着培养时间的延长,蛋白质质量浓度逐渐下降。其中,以卵磷脂为磷源时,培养液中蛋白质质量浓度明显高于其他2种磷源,最高达到47.8mg/L,说明蛋白质可能也是菌株LY8溶解卵磷脂的重要物质。
　　
　　2.4.5 氨基酸 Liba等研究固氮细菌溶磷时发现,溶磷的主要分泌物为氨基酸。而本研究结果表明,3种磷源条件下,菌株均能分泌一定数量的氨基酸,且没有明显差异(图6),说明氨基酸与菌株LY8的溶磷能力关系不大。
　　
　　3 结论

　　通过初筛和复筛得到1株高效兼溶无机磷(磷酸钙)和有机磷(卵磷脂)的溶磷菌LY8,其在2种难溶磷液体培养基中培养6d后水溶性磷含量分别达到647.8mg/L和26.6mg/L。结合生理生化试验并经过16SrDNA序列分析,初步确定LY8为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

　　贫磷条件促进LY8菌株分泌有机酸、蛋白质、多糖和酸性磷酸酶,但在不同难溶磷源条件下其分泌的主要溶磷物质不同。对于无机难溶磷磷酸钙,LY8菌株分泌的主要溶磷物质是有机酸,其次是磷酸酶;而对于有机难溶磷卵磷脂,LY8菌株分泌的主要溶磷物质是磷酸酶,另外其分泌的有机酸、蛋白质和多糖可能也具有一定的溶磷效果,但蛋白质和多糖是缺磷胁迫诱导溶磷菌产生的,还是溶磷过程中所必需的物质,需要进一步研究。

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