2.2.2中性土壤中酸性磷酸酶活性的吸光值
如表3所示， 用DPP 1测定时， 尽管10个土样的吸光值在0.05水平下差异性显着， 但极差仅为0.007.用DPP 2和PNPP测定时， 10个土样吸光值大小的变化趋势一致，但变化幅度不同。用DPP 2测定时， 吸光值介于0.061和0.041之间， 极差为0.020; 用PNPP测定时， 吸光值介于1.012和0.475之间， 极差为0.537, 是DPP 2的26.85倍。此外， 用PNPP测定时， 10 个土样吸光值之间的变异系数为23.56%, 较 DPP 2增加了42.44%.
2.2.3碱性土壤中酸性磷酸酶活性的吸光值
3种方法所测得碱性土壤中酸性磷酸酶活性的吸光值如表4所示。从表中可以看出， 用DPP 1测定时， 吸光值变化不大， 且有部分负值。用DPP 2和PNPP测定时， 尽管10个土样吸光值的变化趋势一致，但用DPP 2测定时， 0.05水平下10个土样吸光值的差异性变化为a~b, 而用PNPP测定时， 差异性变化为a~h.此外， 用PNPP测定时， 10个土样吸光值之间的极 差 为 0.276, 是 DPP 2 的 39.43 倍 ; 变 异 系 数 为35.66%, 较DPP 2增加21.17%.
2.3缓冲液p H和苯酚浓度对显色反应的影响
本研究采用DPP 1测定酸性磷酸酶活性时， 即 使在酸性土壤中酸性磷酸酶占优势的情况下， 也未能获得满意的结果。而采用DPP 2测定时， 溶液中苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺反应并呈现蓝色。这是否与缓冲液p H有关或者酸性磷酸酶活性低而形成的酚含量过低有关尚待进一步研究。为减小土壤对酚含量测定的干扰， 本研究测定了不同p H缓冲液下不同苯酚浓度的吸光值。结果表明， p H和苯酚浓度对吸光值的影响极显着， 且p H影响最大， 苯酚浓度次之（表 5）。此外， 从图2可以看出， 当缓冲液p H为4.0和6.0时，随着苯酚浓度的提高， 吸光值未出现增加的趋势，且变化不大； 当缓冲液p H为8.0和10.0时， 随着苯酚浓度的提高， 吸光值逐渐增大。且当缓冲液p H为8.0时， 苯酚浓度与吸光值之间的Pearson相关系数为0.969, 苯酚浓度每增加1 ?g×m L-1, 吸光值增加0.007;当缓冲液p H为10.0时， 两者之间的Pearson相关系数为0.998, 苯酚浓度每增加1 ?g×m L-1, 吸光值增加0.048.相关系数均在0.01水平下显着相关。
3 讨论
在酸性条件下， 不同浓度的苯酚显色差异不明显； 而在碱性条件下， 随着苯酚浓度的增加， 吸光值呈现增加的趋势。且p H越大， 斜率越大， 苯酚的灵敏度越高。所以说酸性环境不利于苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺的显色， 而在碱性条件下可得到显色结果， p H低是导致高苯酚浓度显色效果差的一个关键原因。这与前面引言中酸性条件下不利于苯酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺显色的假设相一致。
p H低是影响苯酚含量测定的一个原因， 这也被一些学者的研究所支持。如夏栋等[26]的研究表明p H低于8的缓冲液不利于苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺的显色， 显色时间缓慢， 甚至不显色； 适宜显色的p H为8~10, 且9.4更为合适[24].Halstead[27]在研究p H对磷酸酶活性的影响时， 使苯酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺在碱性环境下显色。此外， 有部分学者参照《Methodsin Soil Biology》进行磷酸酶活性的测定， 在显色时加入碱性硼酸盐缓冲液[25].这在一定程度上支持了DPP 2的测定方法。由于培养结束后加入硫酸铝溶液并过滤， 此时已终止反应。此后加入碱性缓冲液只是起到在显色时提供一种碱性环境的作用来有利于苯酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺反应生成兰色的靛酚盐，而不参与酶促反应。因此， 在显色时加入碱性硼酸盐缓冲液并不会影响酸性磷酸酶活性的测定。
尽管采用 DPP 2 可以得到显色结果， 但如果同时考虑无土壤和无基质对照， 吸光值会出现负值，这可能与土样酸性磷酸酶活性偏低有关。此外， 不管是在酸性、中性还是碱性土壤中， DPP2 方法测定的 10 个土样吸光值之间的变异系数都小于用 PNPP测定时所得到的结果， 所以其灵敏度不及 PNPP.而采用 PNPP 以对硝基苯磷酸二钠为基质， 经过酸性磷 酸 酶 的 酶 促 反 应 形 成 对 硝 基 酚 , 在 加 入 等 量Na OH 溶液的情况下， 可获得快速且准确的显色效果， 且培养时间与对硝基酚生成量成正比[14].虽然在选定的碱性土壤中酸性磷酸酶的活性较低， 也能获得满意的测定结果。
本研究只是针对不同p H范围的土壤进行测定比较， 并未考虑土壤的其他性质。建议今后对于我国主要土壤类型进行不同方法之间更加系统和深入的研究。
4 结论
基于以磷酸苯二钠为基质测定酸性磷酸酶活性时， 加醋酸盐缓冲液即在酸性条件下不利于苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺显色， 即使苯酚浓度增加， 也未能获得满意的吸光值； 加硼酸盐缓冲液即在碱性条件下虽然可以显色， 但其灵敏度不及以对硝基苯磷酸二钠为基质测定酸性磷酸酶活性的结果。无论是酸性土壤、中性土壤还是碱性土壤， 基于以对硝基苯磷酸二钠为基质的测定方法， 均能得到满意的结果。总之， 不管是测定酸性、中性还是碱性矿质土壤的酸性磷酸酶活性， 如果选用磷酸苯二钠为基质，应在显色阶段加入碱性硼酸盐缓冲液； 而选用对硝基苯磷酸二钠为基质测定土壤酸性磷酸酶活性， 是更为简单和灵敏的方法。
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