七氟醚于1968年由Regan合成,1986年完成3期临床试验,1990年首先由日本的药监部门批准临床使用。近年来,被许多著名麻醉学专家誉为吸入麻醉的里程碑式药物。研究表明,七氟醚可抑制结肠癌细胞和喉癌细胞的生长,以及肺癌细胞的黏附。但七氟醚对人乳腺癌细胞株黏附能力的影响尚未见报道。
CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白,属于黏附分子,其分布十分广泛,功能主要参与细胞间及细胞与基质间的特异性粘连过程,且在恶性肿瘤的发生、发展中起着十分重要的作用。目前,CD44作为多种已知肿瘤干细胞的标记物,包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝细胞癌。
CD44参与了这些肿瘤的发生、发展、复发和转移的过程。本研究拟评价七氟醚对人乳腺癌细胞株MCF-7黏附能力、CD44表达的影响。
1、材料与方法
1.1主要试剂与仪器
人乳腺癌细胞株MCF-7(南华大学研究所),1640培养基、10%胎牛血清(Hyclone公司,美国),麻醉气体监测仪(DatexAS/3公司,芬兰),AestivaR/5型麻醉机(DatexOhmeda公司,芬兰)。
1.2方法
1.2.1细胞培养。MCF-7细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。
1.2.2实验分组与处理。取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞,采用随机数字表法,将其随机分为4组:不经任何处理的Control组、1.7%七氟醚作用的Treat1组、3.4%七氟醚作用的Treat2组和5.1%七氟醚作用的Treat3组。
1.2.3细胞黏附实验。分别处理好细胞将100μL细胞悬液加入96孔板中,继续培养1h。每孔加入200μL磷酸盐缓冲液(PBS)振摇5min,洗2遍。弃PBS后加入噻唑蓝(MTT),用酶标仪于波长490nm测定吸光度值,并计算黏附率=(各实验孔黏附细胞吸光度值/对照孔黏附细胞吸光度值-1)×100%。
1.2.4CD44mRNA表达的测定。采用qRT-PCR法测定CD44mRNA的表达qRT-PCR反应:反应体系为20μL,包括稀释后的RT产物2μL、2×qRT-PCR缓冲液10μL、5μmol/LmiR-155特异性PCR引物0.4μL、5U/μL耐热DNA聚合酶0.2μL、灭菌双蒸水7.4μL。反应条件:先95℃3min活化Tag酶;然后95℃12s、62℃35s共40个循环。
1.3统计学处理
采用SPSS16.0软件进行分析,组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 4组人乳腺癌细胞株MCF-7细胞黏附能力的比较与处理前比较,Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞黏附率降低(P<0.05);与处理2h比较,Treat2组和Treat3组处理4和6h细胞黏附能力降低(P<0.05);与处理4h比较,Treat2组和Treat3组处理6h细胞黏附能力降低(P<0.05);与Control组比较,Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞黏附能力降低(P<0.05);与Treat1组比,Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞黏附能力降低(P<0.05);与Treat2组比,Treat3组处理2、4和6h细胞黏附能力降低(P<0.05),见表1。
2.2 4组人乳腺癌细胞株MCF-7细胞CD44mRNA表达改变与处理前比较,Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞CD44的mRNA表达下调(P<0.05);与处理2h比较,Treat2组和Treat3组处理4和6h细胞CD44的mR-NA表达下调(P<0.05);与处理4h比较,Treat2组和Treat3组处理6h细胞CD44的mRNA表达下调(P<0.05);与Control组比较,Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞CD44的mRNA表达下调(P<0.05);与Treat1组比,Treat2组和Treat3组处理2、4和6h细胞CD44的mR-NA表达下调(P<0.05);与Treat2组比,Treat3组处理2、4和6h细胞CD44的mRNA表达下调(P<0.05),见表2。
3、讨论
乳腺癌是女性第一大恶性肿瘤,据美国癌症协会(ACS)2011年数据统计,2008年世界女性乳腺癌新发病例1383500例,占女性全部恶性肿瘤的23%,死亡458400例,其中,大约一半的乳腺癌新发病例和60%的死亡例数发生在发展中国家。在中国,乳腺癌的发病高峰年龄则出现在45~50岁,这意味着在中国,乳腺癌已经严重危害了广大处于事业和家庭巅峰时期的女性的生命和生活,成为威胁女性健康的“首要杀手”。其对人类健康的严重危害已引起了世界卫生组织和医疗界人士的高度重视。
越来越多的研究者从癌细胞中筛选出表达一个或多个表面蛋白标记物(CD44、CD24和ALDH1)的细胞,这些表面标志有CD44+/CD24-/Low/ALDH1+的细胞亚群仅占癌细胞总数的0.2%~0.8%,其致瘤能力较其他的癌细胞强100倍,100个这类细胞即可在小鼠乳腺中形成与人类乳腺癌相同的肿瘤并具有干细胞特性,因此,具有这类特异性标记的细胞被认为是肿瘤干细胞,即肿瘤“种子”。这些肿瘤干细胞与肿瘤的发生、发展、复发转移、放化疗抵抗等密切相关。本研究七氟醚浓度为临床常用浓度,七氟醚可以安全而有效地用于成人,儿童和老年人的诱导。其诱导迅速快,不良反应少,心血管稳定性好。与氟烷相比,七氟醚吸入诱导的心血管不良反应少;与异丙酚等静脉麻醉药相比,诱导时间,心血管稳定性和不良反应相似,可以作为临床用药的另一选择。此外,七氟醚吸入诱导还可以用于困难插管患者的麻醉处理和对没有建立静脉通道的患者。本研究结果表明,与处理前比较,处理2、4和6h时,不同浓度七氟醚组细胞黏附率依次降低;与对照组比较,经1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚处理后细胞黏附率依次降低,提示七氟醚可降低人乳腺癌细胞株MCF-7的黏附能力,且呈浓度和时间依赖性。本研究结果表明,与处理前比较,处理2、4和6h时,不同浓度七氟醚组CD44表达依次下调;与对照组比较,经1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚处理后CD44表达依次下调。细胞黏附分子CD44是一种跨膜糖蛋白,其存在一个高度保守的氨基酸末端,与透明质酸结合结构区域之间具有氨基酸序列的高度同源性,CD44具有广泛的组织分布,但目前的研究表明CD44异常表达与肿瘤的黏附及转移相关,CD44表达越高,肿瘤细胞的黏附能力越强。因此,该研究提示七氟醚降低人乳腺癌细胞株MCF-7的黏附能力可能与其抑制CD44的表达有关。
综上所述,七氟醚可降低人乳腺癌MCF-7的黏附能力,且呈浓度和时间依赖性,其机制可能与下调CD44的表达有关。
