摘 要： 按蚊是疟疾的传播媒介,又称疟蚊。在按蚊体内,尤其是肠道内定殖着大量的共生微生物。共生微生物直接或间接地影响蚊虫的营养、发育、繁殖和免疫等重要生理活动。研究表明,肠道共生菌还能影响疟原虫的入侵、发育和传播。按蚊对常用杀虫剂逐渐产生抗性,疟原虫也对抗疟药产生了抗药性,严重阻碍了消除疟疾进程,迫切需要新的疟疾传播阻断战略。利用共生微生物控制和阻断疟疾传播是有潜力的方法之一,因此研究按蚊的共生微生物组成对理解按蚊、共生微生物以及病原体三者间的互作关系,识别用于防控疟疾的候选细菌有重要意义。高通量测序技术的应用有效克服了传统方法的局限性,极大地提高了对按蚊共生微生物多样性的认识。本文将从高通量测序技术在按蚊共生微生物组成、多样性和影响因素及其在疟疾防控中的应用进展进行综述。
关键词： 按蚊; 肠道共生菌; 肠道菌群; 多样性; 微生物组; 综述;
Abstract： Anopheles, also known as the malaria mosquito, is a malaria vector. Anopheles harbors many symbiotic microbes, especially in its gut. Symbiotic microbes play a role directly or indirectly in nutrition, development, reproduction, immunity, and other important physiological activities of mosquitoes. Studies have indicated that gut symbionts can also affect the invasion, development, and transmission of Plasmodium. Worryingly, Anopheles has gradually developed resistance to commonly used insecticides and Plasmodium has also developed resistance to antimalarials, seriously hindering the process of eliminating malaria. Symbiotic microbes with the potential to control and block malaria transmission are being identified and may be used in the future. Hence, the composition of symbiotic microbes in Anopheles needs to be studied to identify potential bacteria for malaria control and to ascertain the relationship among Anopheles, symbiotic microbes, and pathogens. The use of high-throughput sequencing technology effectively overcomes the limitations of conventional methods and has greatly improved the understanding of the persity of symbiotic microbes in Anopheles. This review summarizes the use of high-throughput sequencing technology to study the composition and persity of and factors influencing symbiotic microbes in Anopheles as well as their use in malaria control.
Keyword： Anopheles; gut commensal bacteria; gut microbiota; persity; microbiome; review;
蚊子属于双翅目（Diptera）蚊科（Culicidae），除南极洲外，广泛分布于世界各地[1]，其中的按蚊属（Anopheles）蚊子以吸食人血传播疟疾而广为人知。在长期的进化过程中，蚊子与种类繁多的微生物形成了密切的共生关系，从体壁到消化道，甚至组织细胞内都存在着原生生物、真菌、细菌和古细菌等微生物。细菌是最主要的组成，它们直接或间接地影响昆虫的营养、发育、繁殖和免疫调节等重要生理活动[2,3]。疟疾是全球重要的公共卫生问题之一，世界各国都长期致力于消除疟疾，但长期缺乏有效的抗疟疫苗可供使用，按蚊和疟原虫对杀虫剂和抗疟药物耐药的现象不断产生和扩散，更有频繁的国际旅行和贸易活动，使得消除疟疾形势严峻。
研究表明，肠道共生菌除了广泛参与按蚊的生长发育、营养、免疫调节等生理活动，还影响病原体的入侵和发育。富含共生菌的中肠是疟原虫在按蚊体内发育的关键障碍[4,5,6,7]。因此，了解按蚊体内共生微生物的组成和变化，将有助于提高对共生菌的认识以及识别可用于控制疟疾传播的特定细菌，拓宽消除疟疾的策略。
细菌培养依赖法和非培养依赖法是研究共生微生物的主要方法。蚊虫体内细菌群落多样性高，传统的细菌培养依赖法难以在体外模拟复杂的体内环境，绝大多数的细菌难以分离再培养，限制了发现更多微生物[8]。非培养依赖法将第二代测序技术（next generation sequencing,NGS）和生物信息学分析结合，能够在免培养的条件下获得共生微生物的信息，极大地提高了我们对共生微生物多样性的认识。非培养依赖法在鉴定特定环境中全部微生物方面更有优势，但基于培养的方法可以补充测序依赖法的一些限制[9]。本文主要综述高通量测序技术在按蚊共生微生物多样性中的研究现状，主要包括扩增子测序和宏基因组两大技术的应用及发展趋势。
1、 按蚊微生物组研究方法
微生物组(microbiome)是指一个特定环境或者生态系统中全部微生物及其遗传信息,涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能,其内涵包括微生物与其环境和宿主的相互作用[10]。目前微生物组的研究主要集中在微生物培养、DNA和mRNA三个层面,包括培养组学(culturome)、扩增子(amplicon)、宏基因组(metagenome)、代谢组学(metabonomics)、转录组学(metatranscriptomics)等多组学数据结合应用[11,12]。高通量测序技术分析微生物组的方法,主要包括扩增子测序测序和宏基因组两大技术,在可行的成本下无需分离培养微生物即可获得覆盖整个微生物群落的分类信息和功能基因的数据,以此揭示被人们低估的共生微生物多样性。更全面的比对数据库和更用户友好的分析工具,加速了按蚊微生物组研究的发展,不仅可以更全面地了解微生物群落的组成,还可以破译按蚊生活史中共生细菌的功能。确定微生物群落的种类和比例是16S rRNA测序等扩增子测序研究的主要目标,而宏基因组往往可以提供比16S rRNA测序更高分辨率的信息图谱。值得一提的是,16S rRNA测序与宏基因组两者在测序原理、研究目的、物种鉴定深度和参考数据库等方面上存在差异,前者一般不涉及基因功能的研究。目前,基于标记基因的保守性片段选择合适的通用引物PCR扩增某段或几段高变区,再进行高通量测序的扩增子测序技术在微生物组研究中被广泛的应用,其中的16S rRNA测序可以快速地揭示特定环境中细菌的多样性和丰度,包括未能分离培养的细菌[13]。典型例子如Coon等[5]通过抗生素处理得到无菌的冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)等三种蚊子,使用16S rRNA测序对相同实验室条件下饲养的三种无菌蚊子的孳生地水体、幼蚊和成蚊进行了细菌菌落研究,发现孳生地水体对幼蚊细菌群落有很大的影响,幼蚊体内的大多数细菌存在于孳生地水体中,按蚊成虫可以从幼虫获得其肠道菌群;幼虫依赖于活细菌才能正常蜕皮发育至成蚊。鸟枪法宏基因组在16S rRNA测序的基础上,不受基因拷贝数的影响,将微生物基因组DNA随机打断,再在小片段两端加入引物进行扩增测序,经组装、拼接后无偏地获得研究对象中所有微生物的基因组序列信息,进而分析微生物群落结构,以及预测潜在的基因功能,反映群落的代谢功能,挖掘有应用价值的基因资源。同时,该技术被认为是最准确的分类组成评估方法[14]。宏基因组较16S rRNA测序的优势是显着的,然而,产生海量的序列数据和较高的测序、数据挖掘成本,使得宏基因组在按蚊微生物组研究中不是首选的方法。实践中,通常是先进行16S rRNA测序,获得细菌的组成和多样性,再挑选出感兴趣的对象进行鸟枪法宏基因组研究。例如Dada N等[15]利用宏基因组比较了拉丁美洲重要疟疾媒介淡色按蚊(Anopheles albimanus)对杀螟硫磷(fenitrothion)耐药种群和敏感种群细菌的组成和细菌杀虫剂降解酶丰度的差异。经测序、比对、注释物种和功能后,在杀螟硫磷耐药的淡色按蚊种群中不仅观察到细菌的多样性较低,能降解有机磷的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)有明显的富集,可能降解有机磷杀虫剂的羧酸酯酶和磷酸单酯酶也有明显的富集,并且描述了与杀虫剂降解相关的微生物酶。杀螟硫磷,又名"杀螟松",是世界卫生组织推荐用于室内滞留喷洒(IRS)控制疟疾的一种有机磷类杀虫剂[16]。
2 、按蚊共生微生物多样性
传统的细菌学方法研究按蚊微生物组有许多局限性,直到高通量测序方法的广泛应用,按蚊生命周期中各种因素是如何影响共生微生物的组成和多样性才得以揭示[17,18]。微生物组分析一般包括α多样性和β多样性,由一系列的多样性指数表征。α多样性反映样本内的物种多样性,指按蚊在一个特定区域或者生态系统中的生物多样性,常用Chao1丰富度估计量、香农-威纳多样性指数(shannon-wiener persity index)、辛普森多样性指数(simpson persity index)等表征。β多样性反映样本间多样性的差异,指按蚊在不同区域或者生态系统间生物多样性的差异,常通过主成分分析(principal components analysis,PCA)、非度量多维尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)等作图法间接反映样本间的差异[19,20]。肠道是共生微生物的最大优势栖居地,中肠又是疟原虫在按蚊体内建立感染的关键组织,因此按蚊微生物组的研究集中在雌性按蚊的中肠。共生细菌由按蚊整个生命过程中动态的相互作用形成,根据蚊子生物学和生态学特性的不同,在多样性和丰度方面呈现出很大的变化,受到蚊子的种类、发育阶段、环境和营养状况等因素影响。
2.1、 不同的按蚊种类中共生微生物组成和多样性
蚊子摄入营养物质的种类和数量是决定其共生微生物组成和多样性的重要因素之一,每种蚊子有不同的生态习性,因此暴露于不同的细菌环境中,形成不同蚊种间共生微生物的变异[17]。利用高通量测序的方法研究按蚊共生微生物的多样性,发现按蚊和伊蚊、库蚊成蚊的微生物组共享三个优势分类单元,包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),以变形菌纲细菌为主,γ-变形菌纲囊括的细菌种类最丰富[21,22,23]。主要细菌属的相对丰度因孳生地和蚊种的不同而不同,但它们始终是按蚊微生物组的主要组成。不同按蚊间的菌群存在相似的核心细菌,普遍存在成团泛菌属(Pantoea)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯氏菌属(Burkholderia)、朝井杆菌属(Asaia)、沙雷氏菌属(Serratia)、Thorsellia属、伊丽莎白菌属(Elizabethkingia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)等[15,18,20,24,25,26]。尽管都以变形菌门的细菌为主要组成,但是发现斯氏按蚊(Anopheles stephensi)实验室、野外种群和淡色按蚊(Anopheles albimanus)野外种群的优势细菌均以γ变形菌纲为主,而冈比亚按蚊和库鲁齐按蚊(Anopheles coluzzii,M型冈比亚按蚊)野外种群的优势细菌以α变形菌纲和β变形菌纲为主,没有发现存在按蚊特有的细菌组成[15,27,28]。
2.2、 不同的发育阶段中共生菌的影响
按蚊是变态发育昆虫,卵、幼虫和蛹3个阶段在水中生活,暴露在孳生地大量的微生物中,以水中的碎屑、微生物和小型无脊椎动物为食,细菌是摄食的重要组成部分。成蚊阶段营陆地生活,两性均摄食花蜜和植物汁液,雄蚊主要以花蜜为食,但雌蚊还会吸食脊椎动物的血液以完成产卵。在按蚊的发育中,会以外骨骼脱落、围食膜包裹胎粪排出的形式清除、重塑体内大多数的微生物[29],使得刚羽化的成蚊几乎处于无菌的状态,但有些共生菌可以经龄期传播从蛹传递到成虫,如不动杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属等[5,21]。利用16S rRNA测序研究冈比亚按蚊发育过程中细菌的动态变化。Buck等[30]的研究发现卵阶段的共生菌朝井杆菌、沃尔巴克氏体(Wolbachia)来自于母代的垂直传播。Gimonneau等[27]的研究发现幼虫阶段,肠道共生细菌主要来自于栖息地水体,相比物种多样性最高的栖息地水体,幼虫肠道只检测到一部分水体的细菌,表明肠道共生菌的组成有选择性;羽化成蚊后,共生菌组成结构发生了很大变化,细菌含量减少、多样性降低,如芽孢杆菌科细菌在幼虫中占17%,而在成蚊中不到1%。Wang等[17]的研究发现蛹阶段,绿藻(Chlorophyta)和气单胞菌属(Aeromonas)是最主要的细菌,羽化后随着龄期的增长和不同的营养条件,菌群结构亦表现出明显的改变;新生按蚊肠道微生物的组成几乎相似,但吸食血液和糖类的肠道菌群结构却表现出显着不同,血餐后细菌总量迅速增加而多样性下降,肠杆菌科细菌几乎占据了整个群落,吸食糖类后肠杆菌科细菌占的比例却显着下降。作者Wang等认为,这是由蚊子消化血餐、水解血红蛋白产生大量的游离血红素导致氧胁迫以及丰富的营养供给造成的。
2.3、 不同的孳生地共生菌的多样性
成蚊共生微生物与幼虫孳生地相关,幼虫阶段的环境暴露对确定成蚊肠道微生物构成具有重要作用[27,31]。共生菌主要在幼虫摄食过程中的获得,不同孳生地环境微生物的组成不同,即使是同一孳生地水环境,不同的水层,微生物组成亦有所不同。Gimonneau等[27]在雨季的田间采样进行16S rRNA测序,发现多种来源的细菌,如土壤和植物中常见的不动杆菌属、微杆菌属、金黄杆菌属等;以及不同水层(微表层和次表层)细菌的组成不同。对在不同水层中觅食的两种新生按蚊进行比较,发现即使幼虫和新生成蚊的共生菌组成存在较大差异,但相同的采样点具有非常相似的微生物组成,这与Coon等[5]的研究结果相似。
较实验室使用无菌葡萄糖(或蔗糖)溶液饲养的蚊子,生活在复杂环境的野外蚊子摄食不受控制的天然食物,无论是雄蚊还是雌蚊,其共生菌多样性普遍高于实验室种群。Rani等[28]采用16S rRNA测序和培养依赖法结合的方法筛查了实验室饲养和野外采集的斯氏按蚊中肠的共生菌组成,观察到野外种群的细菌多样性显着高于实验室种群。野外种群的优势菌为类芽孢杆菌科和沙雷氏菌属,实验室种群的优势菌为假单胞菌属和沙雷氏菌属。而Wang等[17]同样采用16S rRNA测序比较冈比亚按蚊实验室种群和野外种群的细菌群落,实验室种群成虫阶段发现的大多数分类群同样存在于野外种群,两者共生菌群结构在科水平上十分相似(主要是肠杆菌科和黄杆菌科),尤其是在血餐后。因此推测蚊体内优势共生菌群与蚊子体内环境相关,与外部条件无关。这也可能与该研究使用实验室保藏蚊子在人工制成的半自然水体模拟野外环境有关。Akorli等[31]使用16S rRNA分析野外获取的冈比亚按蚊中肠微生物组成在实验室定殖过程中世代保存的情况,证实与野外蚊子相比,实验室饲养过程中细菌的大量丢失导致了由少数几种菌属主导的截然不同的共生菌构成,世代保存着部分优势细菌。
2.4、 不同的性别共生菌多样性
蚊子的性别也是影响共生细菌菌群组成的重要因素,许多的研究观察到按蚊共生菌构成在性别上的变异,反映在微生物门的比例变化和物种水平上。雌雄按蚊不同的营养来源以及雄蚊倾向于停留在孳生地附近活动,而雌蚊还会为了寻找吸血宿主和产卵地而活动的范围更大,更易暴露于生物和非生物因素的影响,如携带病原体、污染和季节变化等。雌蚊主要有γ-变形菌纲的细菌定居,如假单胞菌属、沙雷氏菌属和肠杆菌属等,相比之下,雄蚊主要有厚壁菌门的细菌定居,如葡萄球菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等,但是几乎所有雄性蚊子中都存在变形菌纲中的不动杆菌,它是植物花蜜中的一个主要细菌以及广泛分布于自然水体和土壤中[21,28,30]。Rani等[28]利用16S rRNA测序描述斯氏按蚊野外种群的细菌多样性,发现雌雄按蚊共生细菌在属种水平上均发现显着的变异;厚壁菌门细菌是雄蚊的优势分类群,芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、草螺菌(Herbaspirillum spp.)和葡萄球菌属的细菌较多,雌蚊以γ-变形菌纲细菌为主,如不动杆菌属、假单胞菌属、粘质沙雷氏菌、致病杆菌属(Xenorhabdus)等;且发现嗜柠檬酸明串珠菌、木糖氧化无色杆菌、类黄假单胞菌、嗜线虫沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、嗜线虫致病杆菌和格氏勒米诺氏菌仅存在于雌蚊中。
雌雄蚊子摄取不同的营养组分对共生菌意味着有不同的营养供给和选择压力。雄蚊主要摄食糖类的饮食结构中出现的高浓度碳水化合物和酸性环境对某些细菌分类群具有选择性,如醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、Saccharibacter属和朝井杆菌属等[32]。雌蚊吸血后,丰富的营养供给令体内细菌爆发性增长,使共生菌群发生重组,在血餐的不同时期菌群组成也不同,会更倾向于选择含有溶血酶或能促进血液消化的相关细菌,如沙雷氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和Thorsellia属等[17,31]。最后,研究表明按蚊体内的共生菌或能通过直接产生抗疟化合物,或间接地激活、维持按蚊的基础免疫,或资源竞争来影响疟原虫的发育;另一方面,共生菌和病原体之间也发生着相互作用。Tchioffo等[33]利用16S rRNA测序揭示冈比亚按蚊从新生到喂养含有恶性疟原虫血液后不同时间点蚊子的细菌多样性,发现在感染的晚期,沙雷氏菌属的丰度与恶性疟原虫感染有显着的正相关,甲基杆菌属(Methylobacterium)的相对丰度也显着低于未感染的按蚊。也有报道发现感染了恶性疟原虫的按蚊较未感染按蚊,体内细菌多样性更高[26]。
3 、疟疾防控中的应用
数十年来,世界各地在防治疟疾方面取得了重大进展,中国已经进入消除疟疾认证的关键之年。不断报告和扩散的青蒿素耐药现象使得以青蒿素为基础的联合疗法的有效性受到了威胁。另外,采用杀虫剂为核心的病媒控制干预措施也因媒介按蚊对杀虫剂耐药的不断增加而受到挑战。为此,世卫组织曾强烈建议采用"全球范围内可持续病媒控制的创新方法"[16],有潜力的方法之一是使用与按蚊天然相关的共生微生物阻止蚊体内疟原虫的发育和传播。目前,在一些野外生存的按蚊中成功分离出能够影响疟原虫在蚊体内发育的菌株,如沙雷氏菌Y1株[7]、肠杆菌Esp_Z株[34]。要利用按蚊共生菌控制疟疾传播,了解按蚊、共生菌以及病原体三者间的相互关系,就必须更好地了解按蚊微生物组成。按蚊共生微生物的多样性已如前述,目前的研究表明按蚊的微生物组成是动态的,伴随着生活史的转变,其组成发生显着的变化。
4 、总结与展望
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