非综合征性唇腭裂 (NSCL/P) 是一种常见的颌面部先天性畸形 , 全世界的发病率约为 1/500~1/2500［1］。本研究将探讨转化生长因子 α(TGFA) 基因 rs 11466285 多态性与东北地区非综合征性唇腭裂的发病关系。
1资料与方法
1. 1一般资料 非综合征性唇腭裂患者 166 例 ( 病例组 ),正常志愿者 150 例 ( 对照组 )。均为东北地区人 , 并签署了知情同意书。
1. 2方法
1. 2. 1DNA 提取、纯化、PCR 扩增及延伸 将收集到的 5ml 外周血 , 提取基因组 DNA。PCR 总体系为 20 μl(1×PCRbuffer, 0.125 mM dNTPs, 0.4 μM 引物 , 0.05 units Ex Taq, 2.5 ng基因组DNA)。反应条件为94℃ 10 min；94℃ 30 s, 5794℃30 s,7294℃ 30 s, 35 个循环 ；最后 7294℃延伸 3 min。PCR 产物纯化以去除多余的 dNTPs 和引物。特异性引物延伸体系为 15μl［5 μl PCR 产物 , 0.375 μl dATP+0.375 μl dTTP+0.375 μl dGTP+ 0.375 μl Cy3-dCTP, 0.02U VentR (exo-) DNA 聚合酶 , 0.025 μM特异性引物］。反应条件为 9494℃ 3 min ；9494℃ 30 s, 5594℃30 s, 7294℃ 45 s, 35 个循环 ；最后 7294℃延伸 3 min。
1. 2. 2杂交与检测分析 杂交 ：预先将探针点至在醛基修饰的玻片上。将延伸反应产物混合好阳性对照标记物及杂交液同制作好的芯片杂交反应 , 杂交仪 60℃杂交 1 h。杂交后分别在 2×SSC/1% SDS 洗 6 min, 1×SSC/0.2% SDS 洗 6 min,0.6×SSC 洗 3 min, 蒸馏水洗 3 min。检测分析 ：GenePix 4000B 共聚焦激光扫描仪扫描芯片。读取每条探针的荧光信号强度值。基因型通过计算每个 SNP 的等位基因分数 (AF) 读取 ,AF 按照下列公式获得 ：等位基因 B/( 等位基因 A+ 等位基因B)。AF<0.4 为等位基因 A 纯合子 , 0.4 ≤ AF ≤ 0.6 为杂合子AB, AF>0.6 为等位基因 B 纯合子。
1. 3统计学方法 所有数据均采用 SPSS18.0 软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2. 1基因分型 对照组的基因型分布符合 Hardy-Weinberg平衡。为验证基因芯片检测结果的准确性 , 随机挑选 10% 的样本进行直接测序 , 二者结果完全一致。
2. 2病例对照分析 病例组与对照组等位基因和基因型的频率分布情况及比较 , 结果见表 1。rs 11466285 基因型和等位基因频率在病例组与对照组中进行比较 , 结果差异均有统计学意义 ( 均为P=0.001)。
3讨论
TGFA 基因研究最多的是 TaqI、RsaI、C3296T、PrimerP、BamHI 和 PrimerK 等位点［2］。目前 , rs 11466285 多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究非常少, 中国人群的更少。
该 SNP 位点位于基因的 3’非编码区 , 该区域转录成 350 个多聚腺苷酸的反义 mRNA 片段。如果该反义 mRNA 片段通过与 TGFA 基因 rs 11466285SNP 相互作用来调节 TGFA 的表达 , 那么该 SNP 很可能与非综合征性唇腭裂发病相关。本研究运用病例 - 对照法分析了 rs 11466285 多态与中国东北非综合征性唇腭裂的发病关系。
沈亚等［3］研究中国南方人群 rs 11466285 多态与非综合征性唇腭裂的关系时 , 得到了矛盾的结果 , 单体型相对风险分析其与发病密切相关 , 核心家庭传递不平衡检验其与发病不相关。本研究以中国东北人群为实验对象 , 发现基因型和等位基因的频率在病例与对照中均有显着性差异 , 且病例组等位基因 C 频率为 19%, 高于对照组的 9%, 说明携带等位基因 C 与非综合征性唇腭裂的发病密切相关。
参考文献：
［1］ van den Boogaard MJ, Dorland M, Beemer FA, et al. MSX1 mutationis associated with orofacial clefting and tooth agenesis in humans.Nat Genet, 2000, 24(4):342-343.
［2］ Machida J, Yoshiura K, Funkhauser CD, et al. Transforming growthfactor-alpha (TGFA) : genomic structure, boundary sequences, andmutation analysis in nonsyndromic cleft lip/palate and cleft palateonly. Genomics, 1999, 61(3):237-242.
［3］ 沈亚 , 程璐 , 万伟东 , 等 . 非综合征性唇腭裂与干扰素调节因子 6 和转化生长因子 α 单核苷酸多态性的相关性 . 中华检验医学杂志 , 2007, 30(12):1349-1353.
