集约化养殖导致食品动物抗菌药物的广泛使用,造成动物源细菌耐药性不断上升,也出现了很普遍的多重耐药菌甚至泛耐药菌。动物源细菌耐药性不仅会导致治疗失败,直接影响动物的健康和福利[1],也已成为公共卫生的一种重要威胁,为全球普遍关注的公共卫生问题,因而近年来人们加强了对动物源细菌的抗菌药物抗性的监测[1]。
监测的细菌通常包括人兽共患病病原菌、兽医病菌和指示菌[2]。监测革兰阳性菌耐药性的指示菌常选肠球菌,革兰阴性菌耐药性的指示菌为大肠埃希菌。选这些细菌为指示菌是由于其作为人和动物的主要共生菌无处不在,应对抗生素选择性压力可获得耐药性,它们能将耐药性转移给致病菌及共生菌间转移耐药性[3]。
治疗猪细菌性疾病常用的抗菌药物包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、氟喹诺酮类和叶酸拮抗剂等,因而细菌耐药性的监测常为对这些种类药物耐药性监测,以期了解和掌握动物源细菌耐药性产生及扩散程度,利于兽医临床合理选择和使用抗菌药物。
1、材料与方法
1.1、材料
1.1.1、试验菌株
2015年4月分离自河南省洛阳市某猪场健康猪粪样,其中生产母猪大肠埃希菌菌株10株,分别为S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10和S11,育肥猪大肠埃希菌菌株17株,为Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18和Y20,保育猪大肠埃希菌菌株8株,为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8。另有从2个散养户养殖的健康育肥猪分离的大肠埃希菌菌株6株,分别为C1、C2、C3、C4、C5和C6。药敏试验质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。
1.1.2、主要培养基和试剂
营养琼脂培养基、MH培养基,杭州天和微生物试剂有限公司的产品;营养肉汤培养基,北京双螺旋微生物培养基制品有限公司产品。抗菌药物药敏纸片5类11种,分别为β-内酰胺类的氨苄西林(Amp,10μg/片,批号:150407)、阿莫西林/棒酸 (Amc,20μg/10μg/片,批号:150324)和头孢噻肟(Ctx,30μg/片,批号:150116),氟喹诺酮类的萘啶酸(Na,30μg/片,批号:150127)、恩诺沙星(Enr,15μg/片,批号:150205)和氧氟沙星(Ofl,5μg/片,批号:150123),叶酸合成抑制剂类的复方新诺明(Sut,23.75μg/1.25μg/片,批号:150210),四环素类的四环素(Tet,30μg/片,批号:150206)和强力霉素(Dox,30μg/片,批号:150324),氨基糖苷类的庆大霉素(Gen,10μg/片,批号:150104)和大观霉素(Spt,100μg/片,批号:150303),杭州滨和微生物试剂有限公司产品。
1.2、方法
1.2.1、药敏试验
采用临床与实验室标准协会(CLSI)推 荐 的Kirby-Bauer纸 片 琼 脂 扩 散 法 进行[4]。从营养琼脂平板上挑取3个~5个形态特征一致的菌落,用接种环将细菌转移到含5mL适宜的肉汤培养基中。将肉汤培养物置37℃孵育12h。
将菌液均匀涂布于MH琼脂平板。涂布细菌后15min之内在琼脂表面置放药敏纸片。纸片贴好后15min内将平板倒置于37℃培养,16h~18h测定抑菌圈直径,细菌耐药性参照CLSI(2012)标准判定。
1.2.2、数据处理分析。
将对检测某药具抗性或中介的菌株归为耐药菌株;不同来源菌的耐药率为耐药菌株数与检测菌株数之比。
大肠埃希菌抗菌药物耐药率,按照公式:A/Bxl00%来计算,A表示某种猪源大肠埃希菌耐药菌的数量;B表示某种猪源大肠埃希菌所有菌株的数量。计算不同来源菌的多重耐药指数:MARI=a/bc,其中a为代表某来源细菌的总抗菌药物耐药值,b代表检测的抗菌药物种类数目,c代表某来源细菌菌株数,0<MARI<1,MARI值越大说明多重耐药水平越高[5]。
2、结果
2.1、多重耐药指数
由表1可见,散养猪源菌的MARI最 小,为0.12。集约化养殖场猪源菌的MARI为0.57,其中母猪源菌最高,为0.64,保育猪源菌次之,为0.55,育肥猪源菌再次之,为0.53。
表1 不同生长期猪源大肠埃希菌的多抗菌药物耐药指数
2.2、耐药率分析
不同生长期的猪源大肠埃希菌对11种所测抗菌药物的耐药水平如表2所示。
表2 不同生长期猪源大肠埃希菌的耐药水平
散养育肥猪源菌仅对Tet有很高水平的耐药性,对Amp和Dox 3种抗菌药物有高水平的耐药性,对其余8种抗菌药物无耐药性,均敏感。集约化养殖场猪源菌中,无论是保育猪源菌,育肥猪源菌还是母猪源菌,对Amp、Tet和Dox都具有极高的耐药性,耐药率80%~100%;此外,保育猪源菌和母猪源菌对Sut也有极高的耐药性,育肥猪源菌对其有很高的耐药性。对其余7种药物,保育猪源菌,育肥猪源菌和母猪源菌的耐药性不尽相同。保育猪源菌对Spt的耐药水平极高,对Ctx、NA和Gen耐药水平很高,耐药率范围37.5%~50%;对其余3种抗菌药物耐药率为0。育肥猪源菌对Ctx、和NA耐药性很高,对Enr、Ofl、Gen和Spt耐 药 高 性,耐 药 率 范 围23.5% ~41.2%;对Amc无耐药性,均敏感。母猪源菌对Ctx、NA、Gen和Spt有很高的耐药性,耐药水平60%~70%;对Enr、Ofl耐药水平高,均为30%的耐药率;对Amc也无耐药性,均敏感。
2.3、交叉耐药分析
不同生长期的猪源大肠埃希菌对β-内酰胺类的氨苄西林、阿莫西林/棒酸和头孢噻肟,氟喹诺酮类的萘啶酸、恩诺沙星和氧氟沙星,四环素类的四环素和强力霉素,氨基糖苷类的庆大霉素和大观霉素交叉耐药结果见表3。
表3 不同生长期猪源大肠埃希菌的交叉耐药情况
集约化养殖场猪源菌中,100%保育猪源菌交叉耐药菌,交叉耐1类药菌株最多,有B1、B2、B6、B7和B8五株;交叉耐3类药菌株为B3、B4和B5。在8株保育猪源菌中,交叉耐Tet和Dox最为严重,100%菌株交叉耐Tet和Dox;交叉耐Amp和Ctx和交叉耐Gen和Spt菌株比率一样,均为37.5%菌株,均为B3、B4和B5菌株。
17株育肥猪源菌82.4%交叉耐药,其中交叉耐1类药菌株最多,5株分别为Y6、Y9、Y10、Y15和Y16,交叉耐2类药菌株有Y3、Y5、Y17和Y20;交叉耐3类药菌株有Y1和Y8;交叉耐四类药菌株最少,为Y11、Y12、Y13和Y20。育 肥 猪 源 菌 中,52.9%交叉耐耐Tet和Dox,菌株数最多;交叉耐喹诺酮类的菌株次之,其中23.5%菌交叉耐NA、Enr和Ofl,5.9%菌交叉耐NA和Enr;17.6%菌株交叉耐Amp和Ctx,11.8%交叉耐Gen和Spt,相应菌株见表3。
90%母猪源菌交叉耐药,其中交叉耐1类药菌株S5、S6,交叉耐2类药菌株有S7、S8和S10共3株,交叉耐3类的有S1、S3和S7,交叉耐4类的有S2、S11。10株 母 猪 源 菌 中,80%交 叉 耐Tet和Dox,50%交叉耐Gen和Spt,70%菌株交叉耐Amp和Ctx,30%菌株交叉耐NA、Enr和Ofl。33.3%散养育肥猪源菌交叉耐Tet和Dox。
2.4、耐药谱及多重耐药性分析
41株细菌共有19种不同的耐药模式,从耐药谱多样性来看,母猪分离菌最大,10株菌有7种耐药谱;17株育肥猪源菌有耐药谱12种;保育猪分离菌耐药谱多样性最小,8株菌有4种耐药谱(表3)。10种耐药模式有2株及以上的菌株,同一集约养殖场不同生长阶段的猪源大肠埃希菌有菌株具有同样的模式,散养猪源大肠埃希菌和集约化养殖场的猪源大肠埃希菌菌株有些也具相同的模式(表4)。
按照Magiorakos A P等[6]的多重耐药肠杆菌科细菌定义,耐3类及以上的肠杆菌为多重耐药菌,测定的41株细菌,散养猪源菌的耐药模式均非多重耐药模式,多重耐药菌均属集约化养殖场猪源细菌,有13种耐药模式,其中共有Amp-Tet-Sut模式,占集约化养殖场猪源菌82.9%(29/35)。共耐头孢噻肟-恩诺沙星菌株有9株,母猪源菌3株、育肥猪源菌6株。
多重耐药模式中以耐5类药的占绝对优势,有8种模式,其中耐6种药的模式有1种,耐7种药的模式有3种,耐8种药的模式有2种,耐9种药的模式有1种,耐11种药的模式有1种。
耐4类药的菌株有4种模式,其中耐4种药的模式有1种,耐5种药的模式有1种,耐7种药的模式有2种。耐3类药的菌株有1种模式。
集约化猪场分离菌优势耐药模式为Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA-Enr-Ofl、Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA和Amp-Sut-Tet-Dox,菌株数均占检测的集约化猪场分离菌数的14.3%(5/35)
表4 不同生长期猪源大肠埃希菌的耐药模式
3、讨论
本试验所测菌株均分离自一猪一样,一样一株菌,避免菌株来自同一克隆,因而基本代表了调查猪场猪源大肠埃希菌基本状况。
MARI是分析某部位指定菌群如大肠埃希菌耐药性的 极 佳 工 具。菌 株 暴 露 于 常 用 抗 菌 药 物,MARI>0.2,而少用或从不用抗菌药物,MARI<0.2[7]。基于MARI计算结果,散养育肥猪源菌的MARI<0.2,说明这些猪很少用或从没用过抗菌药物,这与我们询问饲养者的结果一致。集约化猪源菌的MARI为0.57,与Su H C等调查华南家畜粪肠杆菌的MARI值0.56结果相近[8]。
我们调查的散养小猪场,仅养殖育肥猪,实行“全进全出”;喂养的饲料均为养殖户自行加工,未添加任何药物添加剂,加之所养猪不曾发病,未采用抗菌药物治疗,因而其大肠埃希菌不曾受到任何抗菌药物压力的选择。分离的大肠埃希菌对临床常用的5大类11种抗菌药物的耐药性只对使用历史较久的抗菌药物Amp、Tet和Dox有一定的耐药性,而对其余8种药物均100%敏感,这样的结果也就不奇怪了。本试验中散养小猪场大肠埃希菌对Amp、Ctx、Gen的耐药率与丹麦2009年、2013年屠宰场猪分离大肠埃希菌耐药率结果相等或接近[9],该国自1999年猪饲料中已禁用抗菌药物作为促生长剂。
本次试验结果表明,该集约化养殖猪场大肠埃希菌的耐药性已相当严重,对检测的11种抗菌药物多数具有较高甚至极高的耐药性。每株细菌至少耐一种抗菌药物,82.9%的菌株为多重耐药菌。总共检测了5类药物,而5重耐药菌株的比例达51.4%。
猪源大肠埃希菌对Amp、Tet、Dox和Sut的耐药性极高,且较其他抗菌药物都高;与国内近些年绝大多数的调查类似,如河南、上海和山东猪源大肠埃希菌规模化猪场大肠埃希菌对Amp、Tet和Sut具极高的耐药性[10-13],河南猪源大肠埃希菌对Dox耐药率也极高[10-11];欧盟、加拿大等国猪源大肠埃希菌耐药性检测表明,其对Amp、Tet、磺胺类的耐药性虽非极高,但也较其他抗菌药物都高。其原因与这些抗菌药物常用有关。
国内外对猪源大肠埃希菌耐药性的调查报告较多,多为致仔猪黄痢、白痢或水肿的大肠埃希菌以及屠宰猪大肠埃希菌的耐药性。对不同生长阶段猪源菌耐药性的调查不多见。目前国内仅见有人对山东、上海和新疆不同生长阶段猪源大肠埃希菌对不同抗菌药物的耐药性进行调查[12,14-15]。其结果与我们不尽一致,这应与使用的抗菌药物不同有关。
本调查的集约化猪源菌耐药多样性大,35株细菌有17种耐药谱。从有限的结果可发现母猪源菌和育肥猪源菌耐药多样性大于保育猪源菌,其原因如何,有待进一步研究。
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