摘 要： 为了优化牦牛乳酸凝干酪生产工艺，以牦牛乳为原料，在单因素试验的基础上，以模糊数学处理牦牛乳酸凝干酪感官评价结果为响应值，采用响应面试验进行分析，确定干酪的最佳工艺参数。对干酪感官品质的影响因素依次为：发酵剂添加量>切割pH值>凝乳温度>氯化钙添加量。最佳工艺参数为：发酵剂添加量0.10%，凝乳温度55℃，氯化钙添加量0.03%，切割pH值4.4，在此条件下，得到的干酪，组织状态细腻，色泽均匀有光泽，滋气味浓郁，牦牛乳酸凝干酪感官评分为95.632，验证试验干酪感官评分为95.517。试验结果可为牦牛乳酸凝干酪的生产加工提供理论基础和参考依据。
关键词： 响应曲面法; 模糊数学; 牦牛乳酸凝干酪; 工艺优化;
Abstract： In order to optimize the processing techniques of yak milk acid-coagulated cheese, the yak milk was used as raw material, Based on the single factor test, the sensory evaluation results of yak milk acidcoagulated cheese were evaluated by fuzzy mathematics, and the response surface test was used for analysis to determine the best processing parameters of cheese. The factors influencing the sensory quality of cheese were as follows: starter culture amount>cutting pH>coagulation temperature>calcium chloride amount. The optimum parameters of starter culture amount, coagulation temperature, calcium chloride amount and cutting pH were found to be: 0.10%, 55 ℃, 0.03% and 4.4, respectively. Under these conditions, the cheese was given a delicate texture, a glossy luster and a rich taste. The sensory scores of the yak milk acid-coagulated cheese and tested cheese were 95.632 and 95.517, respectively. The results can provide theoretical basis and reference basis for the production and processing of yak milk acid-coagulated cheese.
Keyword： response surface; fuzzy mathematics; yak milk acid-coagulated cheese; process optimization;
牦牛乳是青藏高原的优势资源，绿色无污染，富含天然乳钙、免疫球蛋白以及人体所必需的18种氨基酸、α-亚麻酸、共轭亚油酸、花生四烯酸、维生素H等多种稀有营养成分[1,2,3]。酸凝干酪是通过加入发酵剂乳酸菌（LAB）发酵分解乳糖并产生高浓度的乳酸和其他有机酸或酸化剂来使得酪蛋白在其等电点（pH 4.6）形成酪蛋白胶束的一类干酪[4]。干酪中的几种化合物来源于LAB的代谢，在干酪制造过程中，起重要作用并有助于最终产品的质地和风味的发展。在干酪制造过程中，其酸性环境及细菌素可抑制一些致病菌及有害菌的生长，增加食品安全性。同时生产工艺简单，多数为新鲜干酪，风味清新，质地松软，适合中国人的口味[5]。酸凝干酪的滋气味较好，苦味值低于酶凝干酪，这主要是因为在酸凝干酪成熟过程中，原料乳中不添加凝乳酶，通过发酵剂蛋白酶作用于蛋白质，使其轻微降解，令酸凝干酪的滋气味清淡，苦味值低，并有浓郁的奶香味。而在酶凝干酪的成熟过程中，虽然添加的凝乳酶大部分随乳清排出，但是，残留于干酪中的凝乳酶对蛋白质的降解依然难以控制，很容易降解不当或降解过度，导致干酪产生苦味物质、过于浓郁的风味或其他不良风味[6]。
目前，国内外对酶法生产干酪的关键工艺研究较多，包括酶凝新鲜干酪[7]。对于酸凝干酪主要集中在农家干酪和Mozzarella干酪的品质特性上，但对于酸凝型干酪生产工艺的研究比较缺乏，特别是牦牛乳酸凝干酪的工艺研究尚属空白。
在牦牛乳酸凝干酪开发研制过程中，感官评价至关重要，但是由于简单的感官评价依赖各种感官特征，存在明显的主观干扰性，使结果难于准确表达[8]。模糊数学综合评判法兼顾各项指标权重差异以及应用模糊关系综合评判，克服了感官评价的主观性和片面性，使评定结果更趋于合理客观性。
因此，本试验采用响应面结合模糊感官评价法优化牦牛乳酸凝干酪的加工工艺，为生产牦牛乳酸凝干酪提供技术参数。
1、 材料与方法
1.1、 材料与试剂
新鲜牦牛乳：甘肃甘南藏族自治州合作市夏河县。
发酵剂：嗜温（乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种）和嗜热发酵剂（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）按1∶1组成，均由丹麦丹尼斯克公司生产。
氯化钙，乳酸等试剂均为分析纯。
1.2、 仪器与设备
HWS-26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DZ-450A型真空包装机，温州市大江真空包装机械有限公司。
1.3、 试验方法
1.3.1、 干酪制作工艺流程
参照刘兴龙[9]等人的方法并加以改进。原料乳→检验→巴氏杀菌→冷却→添加发酵剂→添加氯化钙→添加乳酸→凝乳→切割、排乳清→搅拌、加盐→堆酿→压榨成型→真空包装。
操作要点：
(1）原料乳：新鲜优质的牦牛乳。
(2）杀菌：采用巴氏杀菌法，在62-65℃保温杀菌30 min。
(3）添加发酵剂：将杀菌乳冷却到35℃左右，添加食盐水做溶剂配制的相应浓度的发酵剂，降低原料乳酸度。
(4）添加氯化钙：为提高加工过程凝块质量，并抑制原料乳中的杂菌，在生产干酪的过程中需添加相应浓度的氯化钙。
(5）添加乳酸：向经发酵并添加氯化钙后的乳中添加适宜浓度的乳酸，促进凝乳。
(6）凝块切割、搅拌和加热：凝块达到一定硬度后，切割成立方体小块，轻微搅拌，使凝块颗粒悬浮在乳清中，使乳清分离，加热可使凝块颗粒稍微收缩，有利于乳清从凝块中排出。
(7）加盐：待排出乳清后，向其中加入2%的食盐。
(8）堆酿：为提高干酪质地，堆酿2 h。
(9）压榨：促使干酪中的乳清进一步排出，并让干酪具备一定的组织状态。
(10）真空包装：干酪成品用LDPE袋进行真空包装。
1.3.2 凝乳时间的测定
从添加乳酸开始计时到凝乳点（pH 4.60）所需时间[10]。
1.3.3、 单因素试验设计
为了确定各个工艺参数对所制作干酪成品品质的影响，并为确定响应曲面优化法试验的各个因素和水平提供合理的依据。选取发酵剂添加量、氯化钙添加量、切割pH、凝乳温度等4个因素分别进行单因素试验。具体为：
发酵剂添加量：分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%。
氯化钙添加量：分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%，0.05%。
切割pH值：控制凝块最终切割pH值分别为4.2、4.4、4.6、4.8、5.0。
凝乳温度：控制凝乳温度分别为45、50、55、60、65℃。
1.3.4、 响应曲面试验设计
采用Design-Expert 8.0软件，依据Box-Behnken设计原理，以凝乳块的综合得分为响应值，选取发酵剂添加量、氯化钙添加量、切割pH值、凝乳温度这4个因素在3个水平上进行响应面试验。共计29组试验，其中5个为中心点。
表1 响应面试验设计因素水平表
1.3.5 、感官评价方法
感官评定方法参照GB/T 5420-2010，随机抽取所制作的干酪样品经过培训筛选后的18人评定小组，采用100分制，从色泽（20%）、组织状态（30%）、滋味和气味（50%）进行质量感官评定。
表2 干酪质量评定标准
1.3.6 、评定论域和权重的确定根据样品感官
质量的指标内容，以及色泽、组织状态、滋气味这3个因素对产品质量影响程度的不同。分别设定感官质量指标集U、评语集V、权重向量A。感官质量指标集U={u1, u2, u3}，其中u1、u2、u3分别表示色泽、组织状态、滋气味。感官质量评语集V={v1, v2, v3, v4, u5}，其中v1、v2、v3、v4、u5分别对应优等（100）、良好（80）、中等（60）、较差（40）、劣等（20）。各因素的权重向量A=（a1, a2, a3）=（0.2, 0.3, 0.5），并且a1+a2+a3=1。
2、 结果与讨论
2.1 、发酵剂添加量对凝乳效果的影响
牛乳的p H一般为6.7左右，酪蛋白以酪蛋白-磷酸钙复合体形式存在于牛乳溶胶中[11]。小角度X散射试验表明，p H由6.6降到5.3时，胶束内磷酸钙逐渐释放[12]。pH 5.2时，所有磷酸盐溶解，进一步酸化至pH 4.6，钙离子完全释放，影响酪蛋白胶束内外钙、磷平衡。适宜的发酵剂添加量有助于干酪形成良好的凝乳、风味和组织状态。
从图1可以看出，随着发酵剂添加量的增加，干酪的凝乳时间呈逐渐减小的趋势。当发酵剂添加量为0.05%时，由于原料乳产生乳酸较少，使凝乳困难，凝乳时间缓慢，凝块质地较软，乳清不易排出；而添加量为0.25%时，由于发酵剂添加量过大，产生的乳酸过多，使凝乳收缩过度，制得干酪粗糙、松散、有渣状感，组织状态较差；而发酵剂添加量在0.10%时，此时凝乳时间短，凝块软硬适度，有弹性，风味口感最佳。这与贺家亮的研究结果一致[13]。
图1 发酵剂添加量对凝乳时间的影响
Fig.1 Effect of starter culture addition amount on coagulation time
2.2 、氯化钙添加量对凝乳效果的影响
在酸化加工过程中，酸度高时，凝乳过快，钙离子的平衡往往被打破，所以在乳中添加钙盐使之恢复平衡就变得非常重要。最常见的方法是添加氯化钙溶液，因为其溶解性好，还可以促进凝乳[14]。
由图2可知，氯化钙添加量较少时，凝乳时间较长，且凝块质地过软，无弹性；氯化钙添加量较多时，虽然减少了凝乳的时间，但凝块组织松散、粗糙，搅拌易碎；当氯化钙添加量在0.03%时，凝块软硬适中，光滑有弹性，凝乳速度也快，凝块的感官品质最好。钙的加入降低了牛奶的pH值，同时增加了酶促反应的速率[15,16]。κ-酪蛋白的水解会在酪蛋白胶束上形成裸露的补丁，可能还会导致钙敏感斑块的暴露。同时，游离Ca2+屏蔽带负电荷的氨基酸残基，从而降低胶束的总电荷，静电排斥力变小，使胶束更加接近并增加聚集[17,18]。胶束之间的钙桥联增加了固化速率，并导致了更硬的凝胶的形成[19]。同时，钙的添加量是有限度的，超过10 mM的任何量都可能对凝乳形成产生负面影响，因为过量的钙会增加胶束表面的正电荷，导致电荷排胶斥和凝胶变弱，或根本没有凝胶作用[20,21]。
图2 氯化钙添加量对凝乳时间的影响
Fig.2 Effects of calcium chloride addition amount on coagulation time
2.3、 切割p H值对凝乳效果的影响
选择原料乳凝乳效果达到最佳的时候切割对于酸凝干酪的产率及其品质具有非常重要的作用[22]。而影响酸凝干酪的凝乳效果最关键因素是切割pH值。因此确定最佳的凝乳切割pH值是非常关键的。由图3可知，切割pH值为4.2时，凝乳时间较长，凝块过软易溶解，凝块松散，搅拌易碎，这是因为pH较低，酸度较高，导致磷酸钙胶束在凝乳中溶解，形成的细凝乳在排乳清过程中损失。当切割pH值为5.0时，虽然凝乳时间短，但是由于酸度低，使得酪蛋白凝结不完全，干物质与乳清分层不明显甚至不凝，乳清不易排出。当pH值为4.4时，凝乳时间适中，凝乳效果最好，凝块组织软硬适度，有弹性，口感风味较好。这与胡颖等人研究一致[23]。
图3 切割pH值对凝乳时间的影响
Fig.3 Effects of cutting pH on coagulation time
2.4、 凝乳温度对凝乳效果的影响
酸凝干酪在凝乳过程中，随着温度的升高，凝乳效果越来越好[24,25]。因此选择合适的凝乳温度对于干酪的产率，感官品质具有重要的影响。由图4可知，随着凝乳温度的升高，凝乳硬度增大，凝乳时间呈先减小后增大的趋势，凝乳温度在55℃时，凝乳时间较短，凝块软硬适中，色泽均匀有光泽，滋气味浓郁。在45℃时干酪凝乳时间长，所得干酪口感略有涩味，组织状态较为松散。
图4 凝乳温度对凝乳时间的影响
Fig.4 Effects of curd temperature on coagulation time
表3 感官评定试验结果
2.5、 模糊感官评定及响应面分析
29组试验组的样品按照表2中的评定标准进行感官评价，评定结果见表3。由表3可以看出，感官评定的结果并不集中，存在差异。不能采用单纯的平均法来处理得到的检验数据，而采用模糊综合评判这种建立在模糊数学基础上的定量评价模式，便可有效地消除人为误差。
将表3中各样品的质量因素各等级评价人数除以总评价人数18，得到29个模糊评判矩阵，分别对应1～29号试验。以第一组为例，其中矩阵中的rij表示干酪的各项评价指标到该指标评价结果的隶属程度。
至R29以此类推。
样品对各类因素的综合隶属度Y=A×R，干酪的感官质量综合评定的结果如下：Y1=A×R1=（0.400, 0.418, 0.177, 0.000, 0.000）同理可得Y2, Y3, Y4, Y5…Y29。
表4 Box-Behnken试验结果
根据综合得分公式：Hm=ΣYm Vn式中，m=1…29, n=1…5，计算综合评分H，如：H1=0.400×100+0.418×80+0.177×60+0.00×40+0.00×20=84.06，同理可得H2, H3, H4, H5…H29。具体结果见表4。
将表4数据进行多元回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为：
感官评价=95.41+1.13A+0.22B+0.88C+0.55D-3.52A2-5.72B2-1.88C2-5.59D2-0.070AB+0.45AC-1.58AD+0.43BC-0.030BD-0.15CD对该模型进行显着性检验及方差分析, 结果见表5。
由表5可以看出，回归模型P<0.000 1，表明模型高度显着；失拟项P=0.301 0>0.05，说明模型失拟项无显着性差异，即模型的拟合程度较好；回归系R2=0.952 6，矫正决定系数Adj R2=0.905 2，说明能解释90.52%的响应值变化，表明此模型可以用来进行牦牛乳酸凝干酪生产工艺参数的分析和预测。
由回归模型系数的显着性检验结果可以看到，模型的一次项中A（发酵剂添加量）、C（切割pH值）显着、且显着性影响大小为A>C，交互项中除了AD交互项有显着差异外，其它交互项均没有显着差异。二次项C2极显着，A2、B2、D2均高度显着。因此可以说明，响应值的变化比较复杂，发酵剂添加量、氯化钙添加量、切割pH值、凝乳温度对酸凝干酪感官品质的影响不是一个简单的线性关系，并且以上四个因素对干酪感官品质的影响大小依次为：发酵剂添加量>切割pH值>凝乳温度>氯化钙添加量。
图5和图6是由多元二次回归方程所做的因素间相互作用对牦牛乳酸凝干酪感官影响的响应面图和等高线图。由图可知，在发酵温度和发酵时间一定的条件下，随着发酵剂添加量的增大和凝乳温度的升高，感官评分先升高后降低，凝乳温度对应的响应面坡面较平缓，说明其对响应值的影响不大，而发酵剂添加量对应的响应面的坡面坡度相对陡峭，说明响应值对其处理条件的改变非常敏感。当其他条件一定时，发酵剂添加量与凝乳温度的等高线图呈明显的椭圆型，再结合其显着性检验结果可知，发酵剂添加量与凝乳温度的交互作用显着。
2.6 、最佳工艺条件的确定及验证
通过Design-Expert软件分析，牦牛乳酸凝干酪最佳工艺条件为：发酵剂添加量0.11%、氯化钙添加量0.03%、切割pH值4.45、凝乳温度55.10℃。在此条件下感官最佳得分为95.632。
采用优化后的工艺条件进行3次验证试验，为了便于实际操作，工艺参数修正为发酵剂添加量0.10%、凝乳温度55℃，切割pH值为4.4，氯化钙添加量不变，最后所得感官评分为95.517，比理论值低0.115%，可见模型能够较好地预测试验结果。
3、 结论
本研究在单因素试验的基础上，利用响应面法结合模糊数学感官评定对牦牛乳酸凝干酪生产工艺进行了优化，建立了牦牛乳酸凝干酪感官品质与发酵剂添加量、氯化钙添加量、切割pH值、凝乳温度4个因素的二次多项式回归模型，实验证明该模型合理可靠。4个因素对干酪感官品质的影响大小依次为：发酵剂添加量>切割pH值>凝乳温度>氯化钙添加量。最优工艺参数为发酵剂添加量0.10%、凝乳温度55℃，氯化钙添加量0.03%，切割pH值4.4，在此条件下，牦牛乳酸凝干酪感官评分为95.517。
表5 回归模型系数显着性检验
注:*为P<0.05, 具有显着性;**为P<0.01, 具有极显着性;***为P<0.0001, 具有高度显着性。回归系数R2=0.9526, Adj R2=0.9052
图5 发酵剂添加量和凝乳温度对感官评分影响的响应曲面图
Fig.5 Response surface plot of the effects of starter culture addition amount and curd temperature on the sensory score
图6 发酵剂添加量和凝乳温度对感官评分影响的等高线图
Fig.6 Contour plot of the effects of starter culture addition amount and curd temperature on the sensory score
参考文献
[1]李亚茹, 郝力壮, 牛建章, 等.牦牛乳与其他哺乳动物乳功能性营养成分的比较分析[J].食品科学, 2016, 37 (7) :249-253.
[2]FOX PF.Fundamentals of cheesescience[M].US:Springer US, 2017.
[3]MIREILLE Y, RIJNEN L.Cheese flavour formation by amino acidcatabolism[J].International Dairy Journal, 2001, 11 (6) :185-201.
[4]SETTANNIL, MOSCHETTIG.Non-starter lactic acid bacteriaused to improve cheese quality and provide health benefits[J].FoodMicrobiology, 2010, 27 (6) :691-697.
[5]吴槟.直接酸化法生产类夸克干酪技术的研究[D].东北农业大学, 2010.
[6]GARC?A V, ROVIRA S, TERUEL R, et al.Effect of vegetable coagulant, microbial coagulant and calf rennet on physicochemical, proteolysis, sensory and texture profiles of fresh goats cheese[J].Dairy Science and Technology, 2012, 92 (6) :691-707.
[7]李玉菲.新鲜干酪生产工艺的优化及生产中HACCP的应用[D].济南:山东师范大学, 2013.
[8]赵紫微, 潘道东, 魏艳, 等.响应曲面法结合模糊数学优化低脂干酪生产工艺[J].中国食品学报, 2013, 13 (9) :62-70.
[9]刘兴龙, 甘伯中, 李帆, 等.白牦牛乳硬质干酪加工工艺技术研究[J].食品科学, 2009, 30 (14) :94-98.
[10]EKINCI FY, GUREL M.Effect of Using Propionic Acid Bacteria as an Adjunct Culture in Yogurt Production[J].Journal of Dairy Science, 2008, 91 (3) :890-899.
[11]BROYARD C, GAUCHERON F.Modifications of structures and functions of caseins:a scientific and technological challenge[J].Dairy Science&Technology, 2015, 95 (6) :831-862.
[12] CHOI J, HORNE DS, LUCEY JA.Effect of insoluble calcium concentration on rennet coagulation properties of milk[J].Journal of Dairy Science, 2007, 90 (6) :2612-2623.
[13]贺家亮, 李开雄, 侯玉泽, 等.发酵剂添加量对半硬质干酪品质的影响研究[J].食品科学, 2009, 30 (6) :120-122.
[14]SANDRA S, HO M, ALEXANDER M, et al.Effect of soluble calcium on the renneting properties of casein micelles as measured by rheology and diffusing wave spectroscopy[J].Journal of Dairy Science, 2012, 95 (1) :75-82.
[15]JENJJ, USASHWORTH.Factors influencing the curdt ension of rennet-coagulated milk.Salt balance[J].Journal of Dairy Science, 1970, 53 (9) :1201-1206.
[16]BRINGE NA, KINSELLA JE.Influence of calcium chloride on the chymosin-initiated coagulation of casein micelles[J].Journal of Dairy Research, 1986, 53 (3) :371-379.
[17]DALGLEISHDG.Coagulation of renneted bovine casein micelles:Dependence on temperature, calcium ion concentration and ionicstrength[J].Journal of Dairy Research, 1983, 50 (3) :331-340.
[18]DALGLEISHDG.Measurement of electrophoretic mobil ities andzeta-potentials of particles from milk using laser Doppler electrophoresis[J].Journal of Dairy Research, 1984, 51 (3) :425-438.
[19]HOOIJDONK ACMV, HAGEDOORNHG, BOERRIGTERIJ.The effect of various cations on the renneting of milk[J].Netherlands Milk&Dairy Journal, 1986 (40) :3296-3305.
[20]UDABAGE P, MCKINNON IR, AUGUSTIN MA.Effects of mineral salts and calcium chelating agents on the gelation of renneted skim milk[J].Journal of Dairy Science, 2001, 84 (7) :1569-1575.
[21]CHOI J, HORNE DS, LUCEY JA.Effect of insoluble calcium concentration on rennet coagulation properties of milk[J].Journal of Dairy Science, 2007, 90 (6) :2612-2623.
[22]TUCKEYSL.ProPerties of casein important in making cottage cheese[J].Jounal of dairySeienee, 1963 (46) :324-326.
[23]胡颖, 蒋纬, 朱秋劲.保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌发酵夸克的工艺条件优化[J].食品科学, 2013, 34 (5) :186-190.
[24]付香斌, 宋淑红, 王明道.酸凝奶酪生产工艺研究[J].安徽农业科学, 2011, 39 (22) :13547-13548.
[25]仰伟栋, 任发政, 张晓莹, 等.奶油干酪生产关键工艺参数研究[J].食品科学, 2010, 31 (14) :309-312.
