血细胞是鱼类机体免疫的重要组成部分，对维持鱼类机体内环境的稳定有重要作用，其部分参数可反映鱼类的健康状况[1].国内外有很多关于鱼类血细胞形态结构的研究[2~9].中华鲟 （Acipenser sinensis）隶属鲟形目 （Acipenseriformes）鲟科 （Acipenseridae）鲟属 （Aci-penser），主要分布在长江流域，是典型的溯河洄游鱼类。由于过度捕捞、葛洲坝等水利工程建设、江上作业和水域污染等原因，中华鲟野生种群数量急剧下降，1988年中华鲟被列为国家一级保护动物[10].
目前有关中华鲟的研究报道主要集中在人工繁殖、行为学、生理生化等方面的研究[11~13],但是专门对中华鲟外周血细胞形态结构的研究比较少。本研究对中华鲟血细胞的显微结构进行观察，旨在为中华鲟血液学、疾病诊断的研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1试验材料
选取4尾养殖中华鲟进行血液样品采集。实验鱼健康状况良好，均为雌性，体长162~182cm,体重20.7~36.7kg.
1.2试验方法
1.2.1采血方法用帆布担架捞取实验鱼后，腹部朝上，鳃部供水。擦去臀鳍后的水分，用5mL一次性注射器自尾鳍基部下方的尾静脉抽取静脉血2mL,迅速将血液注入附有EDTA-K2的抗凝管中，颠倒180度5~8次混匀后，放入4℃冷藏箱中，带回实验室待测。
1.2.2红细胞密度统计按林浩然[14]的方法进行。
1.2.3白细胞分类计数和各类血细胞大小测量抗凝血在干净载玻片上涂片，晾干，用瑞氏-吉姆萨染液联合染色。在Leica显微镜油镜下进行血细胞观察、测量细胞大小，用南京倍宁医学病理成像系统进行观察、拍照。每尾实验鱼制作2张血涂片，每张涂片上计数200个白细胞，对1600个白细胞进行分类计数。在测量细胞大小时，除数量极少的嗜酸性粒细胞外，其余各种血细胞大小取50次测量平均值。
1.3数据处理
实验数据用Excel软件进行处理，结果均以平均值±标准差 （Mean±SD）表示；照片用Photo-shop 7.0进行处理，同比例缩放图像和标尺。
2 结果与分析
2.1中华鲟外周血细胞的显微形态结构
通过显微镜观察发现，中华鲟血涂片中红细胞的数量最多，白细胞数量较少且单个或少数几个聚集分散在红细胞之间。白细胞包括淋巴细胞、血栓细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，未观察到嗜碱性粒细胞。
2.1.1红细胞 （erythrocyte）红细胞呈椭圆或卵圆形，表面光滑；细胞核形状与细胞形状相似，位于细胞中央，少数略偏位，细胞质丰富。细胞核内染色质疏松，被染成紫红色，无核仁，细胞质被染成粉红色。部分血涂片染色过程中环境偏碱性，细胞呈灰蓝色。此外，还观察到红细胞裂解后形成的 “核影”,被染成粉红色 （图1（a））。
2.1.2淋巴细胞 （lymphocyte）淋巴细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，占据多半细胞空间。细胞质较少，有的呈一薄层包裹细胞核，有的向外伸出形成明显的伪足突起 （图1（b）），有的不可见，细胞近似裸核 （图1（b））。细胞核内染色质致密呈块状，被染成深紫色，细胞质被染成浅蓝色。
2.1.3血栓细胞 （thrombocyte）血栓细胞呈长杆形 （图1（c）、（d）、（e））、圆形 （图1（c））或椭圆形，表面光滑。细胞核呈长杆形、椭圆形或肾形等，位于细胞中央，少数偏位，细胞质较少，仅一薄层包裹细胞核；细胞核内染色质致密，被染成紫红色，细胞质染色较淡，呈粉红色，血栓细胞在血涂片中常见到单个或数个聚集在一起出现 （图1（d））。
2.1.4单核细胞 （monocyte）单核细胞呈椭圆形、圆形或不规则形。细胞核形状多种多样，包括圆形、椭圆形、肾形或马蹄形等，常偏于细胞一侧，细胞质较丰富；细胞核内染色质疏松，被染成紫红色，无核仁，细胞质被染成灰蓝色，染色不均匀且含有空泡 （图1（e）、（f））。在显微镜下，单核细胞和淋巴细胞有时难以区分，前者染色质疏松不匀，细胞质染色灰蓝色，朦胧模糊，而后者染色质致密呈块，染色质浅蓝色，清晰透明（图1（f））。
2.1.5嗜中性粒细胞 （neutrophil）嗜中性粒细胞呈圆形、卵圆形 （图1（g））或不规则形 （图1（h））等，细胞核为肾形、马蹄形或分叶形等，常偏于细胞一侧与细胞膜相切，细胞质丰富。细胞核内染色质疏松，被染成紫红色，无核仁，细胞质染色较浅，呈淡粉红色，有的甚至是无色。
2.1.6嗜酸性粒细胞 （eosinophil）嗜酸性粒细胞呈圆形或卵圆形，细胞核为肾形或分叶形等，常偏于细胞一侧，细胞质丰富。细胞核内染色质致密，被染成紫红色，细胞质中充满了均匀饱满的嗜酸性颗粒，被染成橘红色。在血涂片中偶尔见到，数量极少。2.2白细胞分类计数和各类血细胞大小测定==中华鲟白细胞分类计数和各类血细胞大小测定结果见表1.从表1中可以看出，在细胞数量上，中华鲟白细胞中以血栓细胞数量最多，占白细胞总数48.56%;其次是淋巴细胞，占白细胞总数32.44%;嗜中性粒细胞和单核细胞分别占10.25%和8.38%;嗜酸性粒细胞数量最少，仅占白细胞总数0.37%,极为少见。在细胞大小上，中华鲟白细胞中嗜中性粒细胞的体积最大，其细胞大小为 （20.29±1.62）μm×（16.07±2.89）μm;细胞核大小为 （16.32±1.54）μm×（12.34±2.27）μm;淋巴细胞的体积最小，其细胞大小为 （9.74±2.65）μm×（7.20±0.97）μm;细胞核大小为 （8.34±1.24）μm×（6.83±0.74）μm.红细胞计数结果为 （4.82±0.15）×1011个/L.【1】
3 讨论
3.1中华鲟血细胞组成
中华鲟外周血中红细胞数量占大多数，白细胞数量较少。林光华等[15]认为淡水养殖鱼类血液白细胞以淋巴细胞为主，但在 中华鲟 白 细胞中，血栓 细胞 数量最 多，这 与美国红鱼 （Sciaenops ocel-latus）[16]、淡水石斑 （Cichlasoma managuense）[17]、军曹鱼 （Rachycentron canadum）[2]、长鳍裸颊鲷（Lethrinus erythropterus）[5]、切尾拟鲿 （Pseudobagrus truncatus）[4]、小点猫鲨 （Scyliorhinus canicu-la）[8]、澳洲黑鲷 （Acanthopagrus australis）[7]等相同。嗜酸性粒细胞最少，这与稀有白甲鱼 （Onych-ostoma rara）[6]、淡水石斑[17]、切尾拟鲿[4]等情况相似。粒细胞中，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞均存在，但并未发现嗜碱性粒细胞，这与稀有白甲鱼[6]、淡水石斑[17]、华鲮 （Sinilabeo rendahli）[18]、切尾拟鲿[4]等结果一致；但美国红鱼[16]、犬牙缰虾虎鱼 （Amoya caninus）[3]、斑点叉尾鮰 （Ietalurus pune-taus）[19]、长鳍裸颊鲷[5]的外周血液中均发现嗜碱性粒细胞。
Watson等[20]认为嗜碱性粒细胞在制片过程中极易解体，很难观察到。林光华等[21]则发现草鱼 （Ctenopharyngodon idellus）嗜碱性粒细胞只在幼龄鱼鱼种出现，在成年鱼外周血液中没有。周玉等[22]指出鱼类白细胞分类存在种间差异。本研究中未发现嗜酸性粒细胞，可能是实验过程中导致嗜碱性粒细胞解体，也可能是因为实验鱼不是幼鱼，或者中华鲟血液中没有嗜碱性粒细胞，具体原因需进一步研究。
3.2中华鲟与其他鲟鱼的血细胞特征比较
中华鲟的外周血液中发现了嗜酸性粒细胞，并未发现嗜碱性粒细胞，这与达氏鳇 （Huso dauri-cus）[23]、 高 首 鲟 （Acipenser transmontanus）[19]研 究 结 果 一 致； 但 是 在 史 氏 鲟 （Acipenserschrenckii）[24]
研究中，发现其血细胞中有嗜碱性粒细胞，没有嗜酸性粒细胞。中华鲟血细胞中，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞细胞体积较大，淋巴细胞和血栓细胞较小，与达氏鳇研究结果一致，但是中华鲟外周血细胞数量少于达氏鳇，中华鲟血细胞体积大于达氏鳇，这可能跟2种鲟鱼的年龄、生活环境等有关。
本研究在白细胞分类计数时将血栓细胞归为白细胞，而在达氏鳇[23]、史氏鲟[24]的研究中并未将血栓细胞归为白细胞；作者在光镜下发现中华鲟淋巴细胞大小、着色及形态特征均无明显差异，将其归为一类细胞；章龙珍等[24]也没有对史氏鲟的淋巴细胞进行分类，但是周玉等[23]通过电镜对淋巴细胞内的线粒体、粗面内质网、核孔和核周隙的观察，将达氏鳇的淋巴细胞分为大小2类。因此，中华鲟和达氏鳇、史氏鲟的白细胞分类计数统计结果不便比较。
鱼类白细胞分类仍然有很大争议。在军曹鱼[2]、犬牙缰虾虎鱼[3]、切尾拟鲿[4]等鱼类研究中，血栓细胞都归为白细胞一类；而林光华等[15]将鲢 （Hypophthalmichthys molitrix）、鳙 （Aristichthys nobi-lis）的血栓细胞划分到白细胞系以外。除血栓细胞的归属，淋巴细胞的分类也不相同。很多学者[3~5]将淋巴细胞分成大小2类；Barber等[25]认为淋巴细胞体积是连续变化的，不能用 “大”、 “小”来界定；Ellis[26]也认为不同大小的淋巴细胞可能是同一种细胞的不同功能状态。作者认同周玉等的观点，对于鱼类白细胞的分类应采用统一标准，便于学术交流。
3.3中华鲟血细胞特征与其生态适应性
红细胞是鱼体内运输氧气的主要媒介。林浩然[27]指出鱼类运动能力强弱与其红细胞数量和大小有关；杨严鸥等[28]也认为红细胞数量由大到小的顺序与鱼类运动水平由高到底的顺序是一致的。中华鲟红细胞与常见的白鲢、鳙、草鱼、鲤鱼 （Cyprinus carpio）等鲤科鱼类红细胞相比，数量要少，体积要大，说明中华鲟游泳能力比上述鲤科鱼类要弱；这与蔡露[29]在研究4种鲟科鱼类游泳能力时得出的结果一致。中华鲟的红细胞特征可能是其适宜在水流速度较慢的水底生活，以一些行动迟缓的底栖动物为食的原因。
鱼类血栓细胞具有凝血功能，淋巴细胞是鱼类机体免疫的重要组成部分。中华鲟的白细胞是以血栓细胞和淋巴细胞为主体的系统，两者占白细胞总数的81%;这也可能与中华鲟是大型溯河洄游性鱼类，在砾石底质的江段产卵有关。远距离运动和产卵过程中容易受伤，白细胞以血栓细胞和淋巴细胞为主体的系统，能够使得中华鲟在受伤后快速凝血，并将侵入体内的病原杀死，形成免疫保护。
[参考文献]
[1]赵维信.鱼类生理学 [M].北京：高等教育出版社，1999.
[2]陈刚，周晖，张建东，等.军曹鱼血液指标及血细胞发生的观察 [J].水生生物学报，2005,29（5）:564~570.
[3]叶宁，罗杰，曹伏君，等.犬牙缰虾虎鱼外周血细胞的显微结构 [J].水产养殖，2013,34（1）32~36.
[4]邹远超，岳静，岳兴建，等.切尾拟鲿外周血细胞的显微结构 [J].四川动物，2014,33（2）:234~238.
[5]师尚丽，曹伏君，陈思，等.长鳍裸颊鲷外周血细胞的显微结构 [J].海洋渔业，2014,36（5）:418~423.
[6]代应贵，岳晓烔，尹邦一.濒危鱼类稀有白甲鱼外周血细胞特征 [J].动物学杂志，2014,49（6）:875~885.
