消化酶是生物体内催化各种生化反应的一类特殊的蛋白质，主要作用是消化和分解生物体从外界所摄取的食物，为其生长和发育提供营养物质。水产动物消化酶特性研究是水产动物消化生理研究的重要内容，也是研发专用配合饲料的基础。已有研究表明，水产动物消化酶的分泌受到遗传、食性、年龄、环境以及饲料因素的影响，其中饲料的营养组成，如蛋白质水平，是决定其生长最关键的营养物质，也是影响消化酶活性的重要因素。
中华鳖日本品系( Pelodiscus sinensis，Japanesestrain) ( 农业部品种登记号: GS03-001-2007) 具有遗传性状稳定、生长速度快、抗病力强、营养价值高、养殖经济效益好等众多优点，逐渐受到国内外市场的欢迎。目前，浙江省中华鳖日本品系良种稚鳖的年生产数量为 6 500 万只，年均增长速度达 60%，养殖前景十分广阔。然而，对这一中华鳖新品系的研究多集中在种质和养殖模式方面，关于营养生理的研究较少。饲料蛋白质是水产动物生长必需的营养物质，也是饲料最主要和最昂贵的组成部分，鉴于中华鳖产业生态健康发展的需要，本文拟开展饲料不同蛋白水平对中华鳖日本品系稚鳖生长和消化酶的影响研究，以期为中华鳖日本品系高效环保配合饲料研发提供理论参考。
1、 材料与方法
1． 1 供试动物与饲料
供试动物: 中华鳖日本品系由杭州萧山天福生物科技有限公司提供。试验用稚鳖为刚孵化出来尚未开口摄食的稚鳖，规格一致、健康无病。
供试饲料: 试验原料由宁波天邦股份有限公司提供。以 3% 为梯度，分别配置蛋白含量为34% ( D1) 、37% ( D2 ) 、40% ( D3 ) 、43% ( D4 ) 和46% ( D5) 共 5 组试验饲料，并相应调整饲料中玉米油和 α － 淀粉的含量，以保持各组试验饲料总能大致相等。将试验原料过 100 目筛后准确称重，采用逐级扩大法将微量成分与其他饲料原料混合均匀，手动搅拌 5 min，再放到搅拌机搅拌 15min，将预先混合均匀的玉米油缓慢添加到正在搅拌的预混合料里; 接着往预混合料添加 40% 左右蒸馏水，继续搅拌 15 min; 使用中华鳖专用饲料机，生产试验颗粒饲料。将做好的饲料破碎、过筛，再用塑料袋按组别分装密封，置于 － 20℃冰柜保存备用。饲料配方和营养成分实测值如表 1 所示。
1． 2 养殖试验
经过 2 周驯食后，选取体质健康、规格均匀的稚鳖 225 只( 初始体重 3. 70 ±0. 05 g) ，随机放入 15 个室内养殖箱中( 箱体积 350 L·个－ 1) ，每个箱内放养 15 只鳖，随机投喂 D1 ～ D5 试验饲料，每组饲料对应 3 个重复。养殖箱内一端放置塑料斜坡和平台作为饲料投饵台，加水高度至 25cm，并使用小型增氧机和气石进行增氧。饲养试验期间，每日投饲量为鳖体重 3%左右，分两次投喂( 上午 8∶ 30 和下午 5∶ 30) ，确保饲料在 1 h 左右能被试验鳖基本摄食完毕。残饵及时清理、烘干并称重，用于计算饲料系数。每周换水两次，换水量为箱内水体积 1/3。养殖期间水温保持在29 ± 1℃ 。在正式养殖试验开始前，试验鳖用混合试验饲料预先饲喂 2 周。正式养殖试验 8 周。
1． 3 样品分析与数据计算
饲养试验结束后停喂 24 h，将试验中华鳖逐一测量外形数据，称量体重，再用断头法处死，立即解剖，迅速取出所有内脏，置于冰块中，分离出胃、肠道和肝脏。剪开胃和肠道，用冰冻双蒸水冲洗胃和肠道内壁，经脱脂棉球轻轻擦拭干净后，小心刮下黏膜。将获得的样品放入匀浆器，同时将匀浆器外套置于冰水中，加入 9 倍去离子水，低温下匀浆。匀浆液经高速冷冻离心机( 3 000 r·min－ 1) 离心 10 min，所得上清液即为消化酶样品，置于 － 20℃ 冰箱中保存，相关酶活性指标在 3 d 内测定完毕。
组织消化酶活性使用试剂盒( 南京建成生物工程研究所) 测定。具体指标如下:酶液蛋白浓度采用考马斯亮蓝法进行测定，基本测定原理是蛋白分子具有 － NH3 +基团，当棕红色的考马斯亮蓝显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮蓝染料上的阴离子与蛋白 － NH3 +结合，使溶液变为蓝色，在595 nm 波长下测定 OD 值可计算出蛋白质浓度。计算公式:总蛋白质浓度/( g·L－ 1) = ( 测定管吸光度 － 空白管吸光度) /( 标准管吸光度 － 空白管吸光度) ×标准管蛋白质浓度( 0. 563 g·L－ 1) 。
胃蛋白酶活性定义为: 每毫克组织蛋白在37℃ 每分钟分解蛋白生成 1 μg 氨基酸为 1 个酶活单位。
胰蛋白酶活性定义为: 在 pH 8. 0，37℃ 时每毫克组织蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使反应体系吸光度变化 0. 003 为 1 个酶活单位。
脂肪酶活力定义为: 在 37℃时每克组织蛋白在反应体系中与底物反应 1 min，每消耗 1 μmol底物为 1 个酶活单位。
淀粉酶活力定义为: 每毫克组织中蛋白在37℃ 与底物作用 30 min，水解 10 mg 淀粉定义为1 个酶活单位。
相关参数指标计算公式如下:成活率 =100% × ( 试验结束鳖个数) /( 试验初始鳖个数)增重率( WG) =100% × ( 试验结束鳖体重 －试验初始鳖体重) /( 试验初始鳖体重)饲料系数( FCR) = 饲料摄食量/鳖体增重
1． 4 数据统计分析
试验数据表示为平均数 ± 标准差( Mean ±SD) ，经 SPSS 16. 0 软件进行单因子方差分析( ANOVA) ，再采用 Tukey 多重比较检验均值的差异显著性，显著性水平 P 为 0. 05。
2、 结果与分析
2． 1 饲料蛋白水平对中华鳖日本品系生长的影响
饲料不同蛋白水平对中华鳖日本品系稚鳖生长和饲料利用率的影响见表 2。在饲养试验期间，试验鳖健康状况良好，各组存活率无显著差异( P ＞ 0. 05) 。饲喂 34% 蛋白饲料组的鳖体长显著低于其他各组( P ＜ 0. 05) ，其他各组之间无显著差异( P ＞ 0. 05) ; 鳖体宽随着饲料蛋白含量增加而增加，最大值出现在 43% 蛋白饲料组。试验鳖增重率随着饲料蛋白水平增加而提高，在43% 蛋白饲料组达到最大值; 投喂 46% 蛋白饲料组并不会继续增加鳖的体重。饲料系数呈现下降趋势，最高值和最低值分别出现在 34% 和43% 饲料蛋白组。
2． 2 饲料蛋白水平对中华鳖日本品系消化酶活性的影响
投喂不同蛋白水平饲料对试验鳖消化酶活性影响如表 3 所示。本试验观察到胃蛋白酶活性随着饲料蛋白水平的增加而提高( P ＜ 0. 05) ，其最高值和最低值分别出现在 43% 和 34% 蛋白饲料组。胃脂肪酶活性随着饲料蛋白含量增加呈现下降趋势，但组间差异不显著( P ＞ 0. 05) 。
随着饲料蛋白含量增加，胃淀粉酶活性显著下降，最高值和最低值分别出现在 34% 和 46% 蛋白饲料组( P ＜0. 05) 。肝脏蛋白酶在低蛋白饲料组活性显著低于较高蛋白饲料组( P ＜ 0. 05) ，而脂肪酶和淀粉酶活性随着饲料蛋白含量的提高而降低( P ＜0. 05) 。肠道蛋白酶活性最低值出现在 34%蛋白饲料组( P ＜0. 05) ，其他各组间无显著差异( P ＞0. 05) ; 淀粉酶活性随饲料蛋白水平增加而呈现下降趋势( P ＜0. 05) ，脂肪酶活性没有显著变化( P ＞0. 05) 。
3、 讨论
蛋白质是水产动物生长和能量的主要来源，同时还具有机体组织蛋白更新、修复的生理功能，也是配合饲料最主要和最昂贵的组成部分。业界历来认为中华鳖对饲料蛋白和鱼粉具有较高需求。包吉墅等以酪蛋白为蛋白源，认为幼鳖( 15 ～30 g) 的蛋白需求量为 46. 63%。Nuang-saeng 和 Boonyaratapalin以鱼粉为蛋白源，认为幼鳖最适蛋白水平为 46. 48%。近年来，因进口鱼粉价格上扬而造成的饲料成本持续上涨已成为制约中华鳖产业可持续发展的关键问题之一。因此，不少学者已将目光转向探索降低中华鳖饲料蛋白成本。Xie 等研究报道，将 43% 以上饲料蛋白降至 29% 投喂中华鳖四周，再经过 6周恢复高蛋白饲料投喂，中华鳖生长不受影响。
胡先勤等报道，中华鳖排泄氮( 排泄的氨氮和尿素氮之和) 占总氮摄入量的 36% ～ 83%，远高于鱼类的平均水平( 28% ～55%) ，认为中华鳖氮的利用效率相对较低。张士峰也观察到稚鳖期摄食较低蛋白饲料会促进成鳖的摄食生长，成鳖对低蛋白饲料的适应性可能是因为摄食较低蛋白饲料时减少了粪氮和排泄氮、粪能和排泄能比例，提高饲料利用效率。此外，饲料蛋白水平过高会带来诸多不利影响: 一是造成蛋白质的浪费，提高养殖成本; 二是过量的蛋白质会以能量形式消耗掉而非用于机体蛋白合成; 三是造成氮磷排泄增多，污染水环境，不符合现代生态渔业发展要求。因而，本试验首次针对中华鳖日本品系这一新培育的优良品系，评估其饲料蛋白需求和对消化生理的影响，研究结果发现，中华鳖日本品系幼鳖饲喂 43%蛋白饲料，即可达到最佳生长和饲料利用效率; 过高饲料蛋白对鳖的生长表现并没有起到继续提升的作用。
水产动物摄食不同蛋白质水平的饲料后，为了更好地消化、吸收和利用饲料中的营养物质，消化酶分泌量会出现差异。已有研究表明，水产动物蛋白酶活性在一定范围内随饲料蛋白水平的增加而升高。本试验中也发现类似结果，试验鳖胃、肠道、肝脏蛋白酶活性均随着饲料蛋白水平的增加而呈现上升趋势。这可能是因为饲料蛋白质可以诱导鳖体内酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的分泌，提高其对饲料蛋白的消化与吸收，从而促进了鳖体增重，这在本试验增重率的结果中也得到印证。然而，鳖胃和肝脏蛋白酶活性在 43% 蛋白饲料组，肠道蛋白酶在 40%蛋白饲料组时酶活性即达到最高值; 这表明鳖的蛋白酶活力只在一定范围内随着饲料蛋白水平的增加而增强，且有一个最适值，超过最适值后蛋白酶的活性不再继续提高。已有试验也表明，过高的饲料蛋白会导致消化负担增加，并且过量的蛋白质会因分解代谢增强而被消耗，继而产生有毒的含氮物质，对蛋白酶分泌产生负反馈调节。
本试验观察到中华鳖日本品系的胃、肠道和肝脏脂肪酶活性均随着饲料蛋白水平的增加而有不同程度的下降，这与宝石鲈 ( Scortum ba-coo)，鲮( Cirrhinus molitorella)、瓦氏黄颡鱼( Pelteobagrus vachelli)等的研究结果基本一致; 但花鮕( Hemibarbus maculatus) 肠道中脂肪酶活性不受饲料蛋白含量的影响。水产动物脂肪酶活性通常受其所摄食的食物性质和数量影响，主要是与饲料脂肪水平相关。本试验配制的是等能饲料，饲料蛋白增加的同时降低了油脂的添加量，这可能是造成试验鳖脂肪酶活性降低的因素之一。
淀粉酶主要是由散布于肝脏内的胰腺组织产生，并在肠道中被进一步激活，但不同鱼类淀粉酶的分泌器官存在差异。中华鳖日本品系3 个消化组织中均能检测到淀粉酶，其中肝脏淀粉酶活性最高，其次是肠道，胃最低。有学者指出，鱼类淀粉酶的变化通常是由饲料淀粉含量引起，在淀粉含量相同情况下，氮能比的变化不会引起肠道淀粉酶活性呈现规律性变化; 但也有研究认为摄食不同蛋白含量饲料会改变血液中氨基酸和葡萄糖的水平，继而影响胰蛋白酶和淀粉酶基因的转录与合成，导致酶活性变化。
饲料蛋白水平增加增强了鲈鱼( Dicentrarchus la-brax) 淀粉酶活性; 但草鱼( Ctenopharyngodonidella Val． )和斑节对虾( Penaeus monodon)的淀粉酶活性却呈现下降趋势。在本研究中，投喂高蛋白水平饲料的试验鳖淀粉酶活性要低于投喂低蛋白水平饲料处理组，这可能是因为低蛋白饲料组配方中淀粉添加量要高于高蛋白饲料组; 此外，中华鳖食性为偏肉食的杂食性动物，其在摄食低蛋白饲料时，可能会通过增强淀粉酶活性来提高对饲料的消化利用。
综上，在本试验条件下，中华鳖日本品系稚鳖投喂 43%蛋白饲料即可达到最佳的生长和饲料效率。同时，试验鳖消化酶活性也会根据饲料蛋白水平的变化而作出适应性调整。本试验提示了降低中华鳖配合饲料中蛋白含量的可行性，需在今后生产实践中进一步验证。
