低强度脉冲超声 ( low intensity pulsed ultra-sound，LIPUS) 能够影响机械运动场中运动的细胞、生物大分子等结构，独特的空化效应可以增强细胞生长因子、药物分子等大分子物质的跨膜转运能力，且具有安全、价廉等优势，在软骨修复领域逐渐受到研究者的青睐。研究显示 LIPUS 能够促进关节软骨分泌Ⅱ型胶原，减轻骨关节炎患者的关节疼痛，改善关节功能。该研究通过 LIPUS 干预体外培养兔膝关节软骨细胞，探讨其对关节软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原的影响，并初步筛选最佳的超声作用参数。
1、 材料与方法
1． 1 实验动物 2 周龄健康新西兰大白兔 2 只，体重 150 ～200 g，雌雄不限，由南京江宁区青龙山动物繁殖场提供，饲养于南京中医药大学动物实验中心。
1． 2 主要试剂及仪器 低糖 DMEM、胎牛血清( 美国 Hyclone 公司) ; Ⅱ型胶原酶、胰酶、青链霉素混合液( 美国 Gibco 公司) ; Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒( KGSP03，南京凯基生物公司) ; Ⅱ型胶原免疫组化一抗( AF5710，美国 ACRIS 公司) ; 甲苯胺蓝粉末( 北京索莱宝科技发展有限公司) ; CCK-8( 日本同仁化学研究所) ; 酶标仪( Elx800，美国 BioTek 公司) ;相关超声设备由南京大学声学研究所提供，包括信号源、功率放大器与探头等，频率及强度均可调。
1． 3 兔膝关节软骨细胞的分离与培养 2 周龄新西兰白兔耳缘静脉空气栓塞处死，简易固定后常规消毒铺巾，无菌操作下充分暴露膝关节，用手术刀片轻轻刮取股骨髁关节面处关节软骨，将切取下的软骨碎块儿放入预先置有 3% 青链霉素混合液的 PBS中培养皿中冲洗3 次，切碎至1 mm3大小，再放入预先装有 10 ml、0. 2% Ⅱ型胶原酶的 25 cm2培养瓶内，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内过夜，次日收集消化液于 15 ml 离心管内，1 500 r/min 离心 8min，弃上清液，加入适量完全培养液重悬后接种至25 cm2的培养瓶内，静置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内培养，每 2 ～ 3 d 换液 1 次，待细胞铺满瓶底70% ～ 80% 时进行传代培养。
1． 4 软骨细胞的形态学观察与鉴定
1． 4． 1 形态学观察 倒置显微镜下逐日观察体外培养软骨细胞的形态变化、生长情况，并及时摄片记录。
1． 4． 2 甲苯胺蓝染色 取第 3 代软骨细胞，用完全培养液制成细胞悬液，调整细胞密度为 1 ×105/ ml，按每孔 2． 5 ml 将细胞悬液接种至预先置有经多聚赖氨酸处理过的盖玻片的 6 孔培养板内，制作细胞爬片。常规培养 3 d 后，弃掉培养液，PBS 洗 3 次，常温晾干; 用 4% 多聚甲醛固定盖玻片 1 h; 吸弃多聚甲醛，PBS 漂洗 3 次，常温晾干; 加 1% 甲苯胺蓝浸染 2 h; 去除多余染液，自来水浸洗 1 min，无水乙醇迅速脱水; 镜下观察，满意后晾干，中性树胶封片，拍照。
1． 5 细胞分组及 LIPUS 干预 取第 3 代软骨细胞悬液，调整细胞密度为 1 × 105/ ml 后置于 8 个 ? 35mm 培养皿内，每皿 2 ml，随机分为空白对照组及 3种不同强度的 LIPUS 组，超声强度分别为 40、50、80mW / cm2，每组 2 个皿。各 LIPUS 干预组基础参数为: 中心频率: 1． 0 MHz，脉冲重复频率: 1. 0 KHz，脉冲宽度: 200 μs，作用周期: 50。空白组置于探头下但无超声照射，各 LIPUS 组每日超声辐照20 min，连续照射 3 d。
1． 6 检测指标
1． 6． 1 CCK-8 法检测软骨细胞增殖情况 干预 3 d后，消化收集培养皿细胞，全培重悬后，以每孔 100μl 细胞悬液，接种于 96 孔培养板内，每组 6 个复孔，同时取 6 孔加入不含细胞的完全培养液作为调零组; 向每孔加入 10 μl 的 CCK-8 溶液，将培养板放入培养箱内孵育 3 h 后，于酶标仪上 450 nm 处测各组光密度值( optical dersity，OD) 。
1． 6． 2 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色 收集培养皿内细胞，置于 6 孔板内制成细胞爬片，待细胞完全贴壁后倾去培养液，0. 01 mol/L PBS 漂洗 3 次; 4 ℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 漂洗; 3% H2O2浸泡10 min，PBS 漂洗; 0. 3% Triton × 100 通透 30 min，PBS 漂洗; 山羊血清覆盖盖玻片 10 min; 滴加适量Ⅱ型胶原免疫组化一抗，覆盖玻片 4 ℃ 过夜，PBS 漂洗; 滴加适量二抗滴覆盖 10 min，PBS 漂洗; 加人适量链亲和素标记 HRP，孵育 10 min，PBS 漂洗; 加入DAB 染色液覆盖玻片 10 min，自来水漂洗; 苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察、摄片。
1． 7 统计学处理 采用 SPSS 17. 0 统计软件进行分析，数据以珋x ± s 表示，采用单因素方差分析及Dunnett t、LSD 法比较，检验水准 α = 0. 05。
2、 结果
2． 1 形态学观察 倒置显微镜下见原代培养软骨细胞接种 24 h 后，大部分细胞贴壁，呈短梭形或不规则状，见图 1; 48 h 后，细胞逐渐展开，呈三角形或不规则多角形; 培养 3 d 后，细胞数量明显增多。5d 时，细胞铺满瓶底 80% ～ 90% ，单层细胞成片生长，呈“铺路石”状，见图 2。传代培养细胞贴壁时间较原代细胞稍短，大部分可在 8 h 内即贴壁，生长速度也较快，3 ～4 d 即可传代。前 3 代细胞生长速度较快，形态较稳定，而当培养至第 4 代时，部分细胞呈长梭形生长，开始去分化，且随传代次数增多呈递增趋势。
2． 2 甲苯胺蓝染色 甲苯胺蓝能使细胞中的蛋白多糖等酸性黏液物质变为深蓝色，核酸及其他物质( 如细胞核) 呈紫红色。本研究培养出的软骨细胞经甲苯胺蓝染色后，镜下清晰可见细胞外基质中散在分布着深蓝色的异染颗粒，大部分细胞的胞核被染成紫色，见图 3。
2． 3 不同强度 LIPUS 对软骨细胞增殖的影响 不同强度 LIPUS 照射3 d，CCK-8 法检测所得各组软骨细胞 OD 值经单因素方差分析显示，各组软骨细胞增殖差异不全相同( F =12. 433，P ＜0. 01) 。Dunnettt 法比较显示 50、80 mW / cm2LIPUS 组软骨细胞增殖高于空白组( P ＜0. 01) ，而 40 mW/cm2LIPUS 组软骨细胞 OD 值与空白组相比，差异无统计学意义。
LSD 法进一步比较显示，50 mW / cm2LIPUS 组软骨细胞增殖最为显著，OD 值明显高于 40、80 mW/cm2LIPUS 组，差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) 。见表 1。
2． 4 不同强度 LIPUS 对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响 各组软骨细胞经免疫细胞化学染色后均可见Ⅱ型胶原阳性表达，呈棕黄色异染颗粒，粗略可看出各强度 LIPUS 组的棕黄色异染颗粒较空白组多，提示 LIPUS 能够促进体外兔关节软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。见图 4。
对所得图像采用 Image-Pro Plus 6． 0 软件进行半定量检测与分析，测定Ⅱ型胶原染色阳性表达的面积( Areas) 、积分光密度值( integral optical density，IOD) ，见表 2。不同强度 LIPUS 照射 3 d 后，各组软骨细胞Ⅱ型胶原阳性表达 Areas 值与 IOD 值经单因素方差分析显示，各组软骨细胞Ⅱ型胶原表达水平不全相同( F =83. 949、128． 345，P ＜0. 01) ，Dunnett t法比较显示 40、50、80 mW/cm2LIPUS 组Ⅱ型胶原相对表达水平均高于空白组( P ＜ 0. 01) ，LSD 法进一步比较显示，50 mW/cm2LIPUS 组软骨细胞Ⅱ型胶原表达量最为显著，Areas 值与 IOD 值均高于 40、80 mW / cm2LIPUS 组，差异有统计学意义 ( P ＜0. 01) 。见表 2。
3、 讨论
Naito et al采用强度为 30 mW/cm2、频率 1． 5MHz、脉冲重复频率 1． 0 KHz 的 LIPUS 直接作用于动物模型患处 28 d，发现 LIPUS 能够促进Ⅱ型胶原分泌，从而保护关节软骨。Korstjens et al发现 LI-PUS 能促进体外培养人软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达。张迪 等研究发现 LIPUS 能够提高 SD 大鼠前软骨干细胞的细胞外基质Ⅱ型胶原、转化生长因子 β1 及 Sox9 基因 mRNA 的表达。对其作用机制，众学者也是各抒己见。有研究指出 LIPUS 能够促进 TGF-β1、BMP-2、BMP-4、FGF-7、TGF-β R1、VEGF 等细胞因子的合成，从而发挥生物学效应。
周崑 等则认为当 LIPUS 作用于软骨表面时，超声波可将软骨表面合适大小的物质、分子通过组织间隙被“推挤”进入软骨内，促进软骨细胞与外界进行物质交换，从而发挥相关的生物学作用。
LIPUS 是一种机械波，生物学效应与其强度、频率、作用时间、作用周期等有密切的关系。而目前LIPUS 修复软骨损伤相关参数多是参考了治疗骨折愈合的作用参数，但这些参数并非适用于所有的组织。因此，寻找 LIPUS 干预软骨细胞增殖与基质合成等的最佳刺激频率、强度及时间等参数显得至关重要。目前多数研究显示 30 mW/cm2的 LIPUS在软骨损伤修复中的生物学效应，但最佳的刺激强度至今仍无定论。在 LIPUS 的作用时间上也存在异议，有学者认为超声辐射 10 min 时细胞活性及细胞增殖指数最高，一旦超过 10 min 后，相应生物学效应会随着时间延长而下降。有研究显示用于骨折愈合与软组织损伤的最佳治疗时间是 20min。
本研究 LIPUS 基础参数来源于南京大学物理系声学研究所，其中 LIPUS 刺激强度是基于南京大学声学研究所多年来的研究成果，并参考相关文献而设定，结果表明在 1. 0 MHz 频率、1. 0 KHz 脉冲重复率、200 μs 脉冲宽度基础参数相同条件下，50、80mW / cm2的 LIPUS 均可促进体外软骨细胞增殖，而不同强度的 LIPUS 均可促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且 50 mW/cm2的 LIPUS 的生物学效应最为明显，这也被筛选为本课题组后续实验所需的最佳 LI-PUS 刺激参数。由于研究时间、经费有限，本研究未能对 LIPUS 的全部参数进行优化筛选，对其作用机制及量效关系亦未深入探讨。另外，在三维培养条件下，LIPUS 对软骨细胞的影响，以及在 LIPUS 干预下构建的组织工程软骨修复软骨缺损的效应，值得进一步探索。
