总糖是评价食品质量、营养、风味的重要指标之一.近年来由于生活水平的不断提高,人们对糖的摄入量也越来越关注.许多研究表明: 糖分的摄入与龋齿、肥胖、糖尿病、及某些心血管疾病有关,因此食品中总糖的测定被上升到了一个新的高度.总糖含量测定实验是大学 《生物化学》实验课中一个重要的实验内容,通过本实验能使学生掌握用比色法测定总糖含量的基本原理和方法,加深对理论知识的理解,同时让学生更加熟悉分光光度计的使用,在实验过程中按照教材要求进行实验所需的时间较长,总糖含量不高.在此,笔者对其操作过程进行改进,从而提高总糖含量测定的效率.
1 材料与方法
1. 1 材料、试剂与仪器
材料: 市售白薯; 红薯; 马铃薯.洗净,切碎,晒干,置于烘箱干燥,室温密封保存备用.
试剂: 无水乙醇,天津市富宇精细化工有限公司; 蒽酮,国药集团化学试剂有限公司; 葡萄糖,天津市恒兴化学试剂制造有限公司; 浓硫酸,遵义师范学院化工试剂厂; 以上试剂均为国产分析纯; 水为二重蒸馏水.
仪器: T6 新世纪型紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司; MM823EC8 - PS( X) 型美的微波炉,佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司; 101 -3 型电热鼓风干燥箱,北京科伟永兴仪器有限公司; SHZ - D( Ⅲ) 型循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司; AR124CN 型电子天平,奥豪斯仪器上海有限公司; 80 - 2 型离心沉淀机,江苏金坛市中大仪器厂。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 葡萄糖标准溶液和蒽酮 - 硫酸试剂的配制[1 -2]
葡萄糖标准溶液配制: 精密称取 105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品 10 mg; 置于 100 mL 容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,摇匀,得 0. 1 mg/mL 的葡萄糖样品溶液,备用.2 mol / L 硫酸溶液: 准确移取 111. 11 mL 浓硫酸溶液,定容至 1 L,用于溶解总糖.
蒽酮 - 硫酸溶液配制: 精确称取蒽酮粉末 0. 100 0 g 加入100 mL 的锥形瓶中,加入浓度为 80% 的硫酸,定容至 100 mL,备用.
1. 2. 2 样品溶液改进前和改进后的制备
1. 2. 2. 1 改进前的制备[3]
取一定的白薯样品在烘箱内 105 ℃烘干,恒重后,精确称取 1 g 置于锥形瓶中,加入 80 mL 沸蒸馏水,放入沸水浴.不时搅动,提取 0. 5 h,取出立即过滤,残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤,合并滤液,冷却至室温,用蒸馏水定容至 100 mL.
1. 2. 2. 2 改进后的制备
取一定的白薯、红薯和马铃薯在烘箱内 105 ℃烘干,恒重后,精确称取 1 g 置于锥形瓶中,加入 80 mL 蒸馏水在适当条件下微波加热处理 3 min,将样品过滤,取滤液浓缩至 1/2 体积.用 Sevag( 氯仿∶正丁醇 =4∶1) 试剂除蛋白,离心去沉淀.并加入 4 倍体积无水乙醇室温静置过夜,将沉淀物置于 70 ℃干燥箱中干燥,平行实验三次,求平均值.
1. 2. 3 总糖含量计算
根据葡萄糖标准曲线的回归方程进行计算.
2 结果与分析
2. 1 改进前葡萄糖 标准曲线制作及总糖含量测定[4 -5]
分别从葡萄糖样品溶液中精密移取0 mL、0. 1 mL、0. 2 mL、0. 3 mL、0. 4 mL、0. 5 mL、0. 6 mL 置于试管中,加蒸馏水定容至 1 mL,精密加入蒽酮-硫酸溶液 10 mL.置于沸水中加热7 min 后取出,放入冰浴中冷却,以相应的空白试剂作对照,在波长为 620 nm 下,以吸光度 A 为纵坐标,葡萄糖含量C( mg / mL) 为横坐标制作标准曲线,按照生物化学实验教材的要求,通过制作标准曲线的方法,测出各管样品在 A620时的吸光值,计算平均值,根据 A620平均值从标准曲线( 图 1) 上查出相应的含糖量,得知样品中总糖含量.实验可知,根据此法只能大致估计样品含量为 1. 45%.
2. 2 改进后葡萄糖标准曲线制作及样品总糖含量的计算
分别从葡萄糖样品溶液中精密移取 0 mL、0. 1 mL、0. 2 mL、0. 3 mL、0. 4 mL、0. 5 mL、0. 6 mL 置于试管中,加蒸馏水定容至 1 mL,精密加入蒽酮-硫酸溶液 10 mL.置于沸水中加热 7 min 后取出,放入冰浴中冷却,以相应的空白试剂作对照,在波长为 620 nm 下,以吸光度 A 为纵坐标,葡萄糖含量 C( mg/mL) 为横坐标,绘制标准曲线( 图 2) ,得回归方程为:
A = 15. 478C - 0. 0026,R²= 0. 9992
由此可以得出总糖提取率计算公式:
总糖含量 = [( A +0. 0026) /15. 478 ×10 × V/M/1000]×100%
式中: A---吸光度
M---称取样品质量
V---浸提液体积
通过计算: 白薯中总糖含量为 3. 26%,红薯中总糖含量为4. 31% ,马铃薯为 5. 06% .由此可知,可选用马铃薯为实验材料提取总糖计算含量.
2. 3 样品中总糖含量改进前后的比较
由表1 可知,常规水浴处理所需的时间很长,总糖含量较低; 而微波处理只需极短的时间,并用 Sevag 试剂除蛋白,所得总糖含量较高; 在同样条件下以马铃薯为材料得到的总糖含量比白薯、红薯高,而且马铃薯一年四季都有,材料容易获得.
3 结 论
本文对大学 《生物化学》实验中总糖含量测定的实验进行了探索改进,结果表明: 用微波辅助提取方法,并对其进行提取、纯化和分离的综合性实验研究,得出制备样品中总糖所需的时间短、含量高,改善了实验教学效果.并对材料进行改进,得知马铃薯是提取总糖的较好材料.
参考文献
[1] 张虎,李凯. 微波辅助浸提香菇多糖[J]. 大连民族学院学报,2000,2( 6) : 21 - 24.
[2] 许本波,张世俊,江洪波. 微波辅助法提取山药多糖的研究[J]. 安徽农学通报,2007( 12) : 25 -28.
[3] 魏群,李森,井健,等. 基础生物化学实验. 3 版[M]. 北京,高等教育出版社,2009: 84 -86.
[4] 王秀奇,李淑媛,高天慧,等. 基础生物化学实验. 2 版[M]. 北京: 高等教育出版社. 2008: 103 -105.
[5] 陈均辉,陶力,李俊,等. 生物化学实验. 3 版[M]. 北京: 科学出版社,2007: 13 -14.
