摘 要
小麦（Triticum aestivum L.）是我国和世界最重要的粮食作物之一。小麦的产量和质量直接影响着我国农业的可持续发展和粮食安全。氮元素是植物的三大矿质营养元素之一，影响着小麦的生长发育和产量，长期以来人们通过补施氮肥维持小麦高产，但是氮肥利用效率普遍较低，而且造成了生产成本增加、资源枯竭和环境污染等问题。本研究以“山农 0431×鲁麦 21”衍生的小麦 RIL 群体（176 个家系，SL-RIL）为研究材料，采用苗期营养水培实验，设置高氮（HN）、中氮（MN）、低氮（LN）共 3 种处理，进行两年试验，测定不同氮含量处理下的氮养分效率相关的 14 个性状，并结合分子标记遗传图谱，进行小麦苗期氮营养效率相关的 QTL 分析，为氮营养相关性状的基因克隆和分子标记辅助选择育种提供参考。试验结果表明：
（1）表型变异分析表明，SL-RIL 群体不同氮处理环境下 14 个苗期性状在基因型间均表现极显着差异（p≤0.001）；母本山农 0431 在不同 N 处理环境下所有被测定性状的数值均明显大于父本鲁麦 21；各株系在不同处理下表现出性状变异范围大、超亲现象明显的特点，多数（78.6%）的性状变异系数超过 10%；除 RDW 外，广义遗传力都在50%以上，变异范围为 40.01-90.28%；多数性状间相关性达显着水平。
（2）SL-RIL 群体 3 个氮处理苗期 14 个性状进行 QTL 分析表明，共检测到 168 个QTL，位于 3D 以外的 20 条染色体，单个 QTL 可解释表型变异的 3.30~17.68%，53 个QTL 加性效应为正值，表明 QTL 增加效应来源于母本山农 0431；115 个 QTL 加性效应为负值，表明 QTL 增加效应来源于父本鲁麦 21。
（3）168 个 QTL 中，46 个为 RHF-QTL，涉及除 SNCe 以外的 13 个性状，位于 1A、2A、2B、3B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D 及 7A 染色体上，平均贡献率为 3.71~16.16%。38 个 RHF-QTL 加性效应为负值，说明 QTL 的增加效应来自于父本鲁麦 21；8 个RHF-QTL 的加性效应为正值，则增加效应来自于母本山农 0431。有 20 个 RHF-QTL 在单一 N 环境监测到，22 个 RHF-QTL 在 2 个 N 环境检测到，4 个 RHF-QTL（QTnue.4D.2、QSdw.5A、QSdw.5B-1.2、QRsdw.5D）HN、MN、LN 三种处理均检测到，受环境影响小。
（4）本研究的 QTL 簇指染色体同一位置包含 2 个以上 RHF-QTL。共获得到 9 个QTL 簇（C1~C9），位于 3B、4D、5A、5B、5D、6B、6D、7A 染色体，共涉及 33 个RHF-QTL，占 RHF-QTL 总数的 75.00%，增加效应来自父本鲁麦 21。其中位于 5A 的C3 包括 8 个 RHF-QTL（QRdw.5A、QRnce.5A.2、QSdw.5A、QSnc.5A、QSnue.5A、QTdw.5A、QTnc.5A.1、QTnue.5A），解释平均表型变异的 6.47~11.40%。QSdw.5A 可以在 3 种氮处理中被检测到，QRdw.5A、QSnc.5A、QTdw.5A、QTnc.5A、QSnue.5A、QTnue.5A 在2 种氮处理被检测到，QRnce.5A 仅在中氮条件下被检测到。
关键词：小麦；重组自交系；QTL；氮营养效率；苗期。
Abstract
Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important staple crops in the world. The productivity and quality is very important for agricultural sustainable development and the food supply in China. Nitrogen (N) is one of the three most important nutrients for the growth and yield improvement of wheat. A lot of N fertilizers are supplied every year to grain high wheat productivity. But N efficiency of wheat is relative low, which increased crop production costs, exhausted non-renewable N resources, and caused a series of environmental problems.
In this study, we conduct the quantitative trait loci (QTL) analysis using a set of 176 recombinant inbred lines (RILs) derived from a “Shannong 0431×Lumai 21”(SN0431×LM21)cross (SL-RIL).The 176 RILs and their parents were grown under hydroponic culture in greenhouse. The concentrations of N treatments were high N (HN), moderate N (MN) andlow N (LN). Combined with a high-density genetic map, QTLs were located for N use efficiency traits at the wheat seedling stage. This should be helpful for gene cloning of related traits and molecular marker-assisted selection (MAS) in breeding programs. The main results are as follows:
(1)The variation of phenotype showed that significant difference (p≤0.001) was detected between genotypes in all 14 targeted traits. Relative values of female parent SN0431 wasobviously larger than those of male LM 21 for all traits under different N treatments. For RI lines, the wide variation ranges and transgressive inheritance under different treatments were detected. The variation coefficient for most traits (78.6%) was higher than 10%. The broad-sense heritability ranged 40.01-90.28 % for all traits except for RDW. The correlation coefficients were significant among the most traits.
(2)QTL analysis was carried out for the 14 traits at the seedling stage under three N treatments, the result showed that a total of 168 QTLs were detected on 20 chromosomesexcept for 3D. The individual QTL could explain 3.30%-17.68% of the phenoty picvariations. A number of 53 SN0431 derived QTLs showed positive additive effects, whereas 115 LM21dirived QTLs had negative additive effects.
(3)Atotal of 46 RHF-QTLs were detected on chromosomes 1A, 2A, 2B, 3B, 4D, 5A, 5B,5D, 6A、6B, 6D and 7A for 13 traits except for SNCe. The average contributions ranged from 3.71 to 16.16%. A mumber of 38 LM21 dirived RHF-QTLs showed negative additive effects,whereas 8 SN0431 dirived RHF-QTLs had negative positive additive effects.A number of 20 and 22 RHF-QTLs were found under a single and two N environment(s), respectively. Four RHF-QTLs (QTnue.4D.2、QSdw.5A、QSdw.5B-1.2、QRsdw.5D) were detected under all the three environments, HN, MN and LN, indicating they were affected diminutively by environment.
(4)The cluster was defined as the co-location of RHF-QTLs for more than two traits in this study. Nine QTL clusters (C1-C9) were mapped on eight chromosomes: 3B, 4D, 5A, 5B,5D, 6B, 6D and 7A, including 33 RHF-QTLs (75.00%). The increasing effects of QTLs come from LM21. The cluster C3 included eight RHF-QTLs (QRdw.5A, QRnce.5A.2, QSdw.5A, QSnc.5A, QSnue.5A, QTdw.5A, QTnc.5A.1, QTnue.5A) with the contributions of 6.47-11.40%. QSdw.5A was detected under all the three environments, QRdw.5A, QSnc.5A, QTdw.5A,QTnc.5A, QSnue.5A and QTnue.5A were detected under two environments, and QTnue.5A was detected only under MN.
Key words: wheat; recombinant inbred line (RIL); quatitave trait loci (QTL); N efiiciency; seedling stage。
1 引言
小麦是世界上最早栽培的作物之一，同时也是世界上重要的谷物，全世界 1/3 以上的人口以小麦作为主食，全球贸易量常年保持 1 亿吨以上，居世界首位。2001~2010 年，世界小麦面积和产量分别占粮食作物总面积和产量的29.8%和33.2%（Hischenhuber et al.,2006; Etienne et al., 2008）。小麦是我国北方人民的主要口粮，每年种植面积约 2300 万公顷，占全国粮食消费总额的 1/5 以上，居第三位，仅次于水稻和玉米（何中虎等, 2011）。
氮素是作物生长发育必需的最重要的大量元素。据统计，氮肥施入土壤后，仅有 30～35%被作物吸收（Good et al., 2004）。全球人口的增加对粮食产量提出了更高的要求。
为增加作物产量，大量的氮肥资源被投入农田，然而肥料利用率较低，造成了大量的能源消耗并导致了严重的环境问题（Broadbent et al., 1987; De Datta et al., 1988; Glies., 2005;Schachtman and Shin., 2007; Davidson., 2009;Jin et al., 2017;Zhang et al., 2018)）。近 40 年来，世界范围内粮食产量增加了 2 倍，而氮肥的施用量却增加了 7 倍（Hirel et al., 2007）。
因此，培育养分高效利用的农作物新品种是第二次绿色革命的重要目标，而深入探讨小麦氮效率的遗传基础是进行小麦遗传改良的前提。
氮效率包括氮吸收效率和利用效率两个方面，体现了作物利用土壤中的氮元素构成作物产量的能力。氮吸收效率反映了根系从土壤或培养液中吸收氮素的能力，而氮利用效率则反映了作物体内重新分配利用氮素以维持正常生物量的能力（Kong et al., 2013）。
氮高效表明植株可以在较低水平的氮养分条件下吸收较多的氮（氮吸收效率高），或者单位氮养分可更多地转化为籽粒产量（氮利用效率高）。不少学者开展了小麦氮素利用率研究，主要集中在氮高效生理以及氮素利用率相关性状间的相互关系（Wu et al., 1995;Ladha et al., 1998; Cassman et al., 1998; Singh et al., 1998; Jiang et al., 2004; Tong et al.,2006; Wang et al., 2011; Mahjourimajd et al., 2016），但氮素利用率遗传研究相对较少。
氮营养相关性状是典型的数量性状，数量性状基因座（quantitative trait locus, QTL）分析可以把复杂的数量性状分解成不同的 QTL，并明确 QTL 所在的染色体位置和效应的大小，进而为复杂性状遗传控制的研究提供了一种有效的新方法（Doerge, 2002）。
因此，对氮营养相关性状进行 QTL 分析，可以挖掘控制小麦氮素吸收利用的基因座，进而为小麦育种相关理论研究提供基础。
1.1 小麦氮高效基因型的鉴定。
矿质营养高效的基因型包括两种类型：一是为低肥水平下产量相对较高，但施肥增产效应较低，属于低投入高产出的省肥基因型；二是低肥水平下产量相对较低，但施肥增产效应较高，属于高投入高产出的基因型（顾海永, 2007）。在氮效率方面，小麦存在非常丰富的变异类型。品种改良、氮肥配方施肥和农艺技术的应用是提高小麦氮肥利用效率的有效途径，而选育氮高效作物品种是关键。
小麦氮利用效率的鉴定和评价包括水培、盆栽、大田栽培等方法。一般采用苗期水培或成株期盆栽试验进行初选，然后采用成熟期大田栽培试验进行进一步鉴定。水培法的营养液一般参照 Hoagland（1950）的配方，其中正常氮处理浓度为 0.2 mmol·L-1，低氮处理一般采用 1/10 氮浓度，即 0.02mmol·L-1。在盆栽或大田栽培条件下，氮胁迫环境一般是播种介质中有效氮含量在 15mg·kg-1 以下。也可以根据目标产量确定低氮和高氮处理，如亩产 400kg（低氮）、亩产 600kg（高氮）的需氮量。
氮含量测定是氮利用效率鉴定的基础，但是氮含量测定的步骤繁琐，这在很大程度上限制了氮利用效率的大规模鉴定。不同基因型氮效率的指标主要有产量、生物量、氮素积累量、茎叶氮素累积量、茎叶含氮量、地上部生物量、根生物量等（张锡洲等，2011；赵春波等，2015；赵付江等，2015；黄永兰等，2015；张俊国等，2008；钟思荣等，2017）。
作物的产量是种植者和育种者直接追求的指标，用来评价不同基因型的耐低氮性和氮利用效率也最具有说服力，是主要的氮利用效率的评价指标，但产量评价必须在成熟收获时期进行。人们一直在寻找既能代替含氮量测定，又能简单、快速、直观地反映氮养分效率且遗传力较高的形态指标或生理指标。氮高效鉴定评价应以一个或几个评价指标为主，并辅以多个参考指标综合评价，才能确保试验结果的准确性。路文静等（2009）在不同氮处理条件下，研究了不同氮效率小麦品种的籽粒含量、植株含氮量和植株氮累积量及氮效率相关的生理参数。
不同氮处理下研究表明：不同小麦品种氮利用效率差别很大（Clárk., 1983; Wang etal., 2011）。韩胜芳等（2007）发现不同氮效率小麦品种在氮素同化和代谢关键酶活性上存在着明显的遗传差异。低氮条件下，吸收高效小麦品种的根系干质量大、根系生理活性强，是其植株氮素累积增加的重要原因；利用高效小麦品种的高氮利用效率，主要是由于其较强的氮素同化关键酶活性使植株体内的氮素同化和代谢速率得到改善所致。
杜保见等（2014）对小麦苗期氮素吸收利用效率差异进行了聚类分析，初步确定“扬麦16”和“鉴 76”为正常供氮和高氮条件下的氮高效型品种，“皖麦 68”、“F605014”、“鉴 62”和“安农 1026”为高氮条件下的氮高效型品种。董召娣等（2014）发现相同施氮条件下，半冬性小麦品种的氮肥吸收效率和氮肥生产效率比春性小麦品种分别高12.19%和 9.64%，差异均达显着水平。其中氮肥吸收效率和氮肥生产效率最高的品种均为济麦 22，春性小麦两个指标最高的品种均为扬麦 15。路文静等（2009）在不同氮处理条件下，发现低氮条件下氮高效品种沧核 036 表现的氮高效特征，是其具有较强的氮素吸收和同化能力。
1.2 QTL 定位及其在研究小麦氮效率中的应用。
1.2.1 分子标记和 QTL 定位。
数量性状受多基因控制，存在着复杂的基因型之间、基因型与环境之间的互作机制，随分子生物学和生物统计技术的迅速发展，应运而生的 QTL 作图技术为研究复杂数量性状开辟了新途径。
QTL 作图是通过分析整个染色体组的 DNA 标记和数量性状表型值的关系情况，将QTL 每个都定位到连锁群的相应位点，进而估测其遗传效应。它的一般步骤包括：（1）构建作图群体；（2）确定和筛选遗传标记并构建连锁遗传图谱；（3）检测分离世代群体中每一个体（家系）的标记基因型；（4）测量数量性状；（5）统计分析标记基因型和数量性状值是否存在关联，确定 QTL 在染色体上的数目和位置，估测 QTL 的遗传效应。QTL 定位的必要条件为：（1）高密度的连锁遗传图（一般要求标记间平均距离小于 15-20 cM）和相应的统计分析方法；（2）目标性状在群体中分离明显，符合正态分布，在遗传分析群体构建选择亲本时要尽可能地选择性状表现差异大和亲缘关系较远的材料。
1.2.1.1 作图群体。
作图群体是进行 QTL 定位的基础，其亲本选择的适宜与否是 QTL 定位成败的关键因素之一。作图群体可分为初级和次级作图群体。
因遗传分离特性和遗传背景的稳定性不同，初级作图群体又分为暂时性群体和永久性群体。暂时性群体不能稳定遗传，其遗传组成会因自交、近交而改变，如 F2 群体及衍生的 F2-3，BC1、BC2 等回交后代群体；永久性群体为同一株系内个体间的遗传背景相同、自交后代群体不分离，可永久性用于遗传分析，在不同时间地点进行多年多点试验，为不同实验室所分享，如重组自交系（recombinant inbred lines，RIL）群体、加倍单倍体（doubled haploid，DH）群体等。近年来，大部分 QTL 研究是基于两个亲本构建的 RIL 群体或 DH 群体（Su et al., 2009; Guo et al., 2012; Ryan et al.,2015; Zhang andWang., 2015）。如果选择栽培品种或者骨干亲本作 RIL 群体或 DH 群体的亲本之一，那么将更有利于 QTL 定位结果应用于育种实践。高尚等（2016）利用 90k 小麦 SNP 基因芯片技术，对包含 188 个家系的 RIL 群体进行多态性分析，并利用 JoinMap 构建连锁图谱，图谱包含 7197 个多态性 SNP 标记，构建了包括 43 个连锁群、6573 个 SNP 标记的分子标记遗传图谱，标记间平均间距 0.38cM。Zanke 等（2014）利用 358 个欧洲冬麦品种组成的自然群体，将 732 个 SSR 标和 7934 个 SNP 标记映射到遗传图谱上，定位了控制小麦抽穗期的 72 个 SSR 和 432 个 SNP 位点，并与水稻、两穗短柄草同源序列进行比对，发现在水稻上控制光周期的基因 Hd6 和小麦位 5BL 染色体上控制光周期的基因具有高度同源性。
次级作图群体是指经过杂交、多代回交和分子标记选择与改良形成的群体，常用的有染色体片段代换系（chromosomal segment substitution line, CSSLs）、单片段代换系（single segment substitution lines，SSSLs）、近等基因系（near isogenic lines，NILs）、剩余杂合体群体（residual heterozygous lines, RHLs）等，其共同特点是遗传背景相似，仅带有少数供体亲本的染色体片段，是进行 QTL 精细定位的良好材料。Xue 等（2008）采用 CSSLs 群体图位克隆了 1 个同时控制水稻株高、抽穗期和每穗粒数的基因 Ghd7。
杨德卫等（2010）以 9311 和 Nipponbar 杂交、回交构建的 CSSL 群体为材料，定位到 4个抽穗期相关的 QTL，最终将 qHD-3 和 qHD-8 分别精细定位在第 3 号染色体RM3166-RM16206 和第 8 号染色体 RM4085-RM8271 之间。周勇等（2012）利用广陆矮4 号/日本晴的 CSSL 群体鉴定出 1 个控制抽穗期的主效 QTL-qHd8.1，并利用 BC4F2:3群体精细定位了该基因。
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1.2.1.2 分子标记
1.2.1.3 小麦遗传图谱
1.2.2 小麦氮效率的 QTL 分析
1.2.3 相对稳定 QTL 和 QTL 簇
1.3 本研究的目的意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.2 试验方法
2.2.1 试验设计
2.2.2 试验方法
2.2.3 测定指标
2.2.4 氮浓度测定方法
2.3 数据分析
2.3.1 方差和相关性分析
2.3.2 QTL 分析
3 结果分析
3.1 表型变异和相关性分析
3.2 QTL 分析
3.3 重要的 QTL 簇
4 讨论
5 结论
本研究以 SL-RIL 群体为材料，在 HN、MN、LN 处理测定苗期氮养分效率相关的14 个性状，并进行 QTL 分析。表型变异分析表明，SL-RIL 各株系在不同处理下表现出性状变异范围大、超亲现象明显的特点。QTL 分析表明，共检测到 168 个 QTL，位于3D 以外的 20 条染色体，单个 QTL 可解释表型变异的 3.30~17.68%，53 个 QTL 加性效应为正值，表明 QTL 增加效应来源于母本山农 0431；115 个 QTL 加性效应为负值，表明 QTL 增加效应来源于父本鲁麦 21。168 个 QTL 中，46 个为 RHF-QTL，涉及除 SNCe以外的 13 个性状，平均贡献率为 3.71~16.16%。38 个 RHF-QTL 增加效应来自于父本鲁麦 21；8 个 RHF-QTL 的增加效应来自于母本山农 0431。有 20 个 RHF-QTL 在单一 N环境监测到，22个RHF-QTL在2个N环境检测到，4个RHF-QTL（QTnue.4D.2、QSdw.5A、QSdw.5B-1.2、QRsdw.5D）HN、MN、LN 三种处理均检测到，受环境影响小。共获得 9个 QTL 簇（C1~C9），位于 3B、4D、5A、5B、5D、6B、6D、7A 染色体，共涉及 33个 RHF-QTL，占 RHF-QTL 总数的 75.00%，增加效应来自父本鲁麦 21。QSdw.5A 可以在 3 种处理中被检测到，QRdw.5A、QSnc.5A、QTdw.5A、QTnc.5A、QSnue.5A、QTnue.5A在 2 种氮处理被检测到，QRnce.5A 仅在 MN 条件下被检测到。
参 考 文 献
