新型反相限进材料对蛋白质的排阻特性分析

　　摘要：以溴代硅胶为引发剂，CuBr/2,2-联吡啶为催化体系，在改性硅胶上经二步表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）制备内表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯（C18）、外表面接枝甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）、水解得到表面含大量二醇基的新型反相限进材料。使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、元素分析和热重分析（TGA）对其表征，采用静态吸附实验研究反相限进材料的吸附性能，其对磺胺二甲氧嘧啶和土霉素的最大吸附量分别为 18. 02 和 4. 80mg / g.结合固相萃取（SPE）评价其对大分子蛋白质的排阻性能，以牛血清白蛋白（BSA）作为排阻大分子模型，排阻能力达 90%.将其用于牛奶中土霉素的分离富集，经高效液相色谱（HPLC）检测，土霉素的平均加标回收率为89. 19% ,相对标准偏差为 3. 03% .有望将新型反相限进材料和 HPLC 或液相色谱-质谱（LC-MS）等分析系统结合应用于生物样品的处理和检测。
　　
　　关键词：限进材料；表面引发原子转移自由基聚合；牛血清白蛋白；磺胺二甲氧嘧啶；土霉素；牛奶。
　　
　　Abstract:A novel reversed phase restrict access material was prepared via two steps of sur-face-initiated atom transfer radical polymerization （SI-ATRP）。 The stearyl methacrylate （C18）and glycidylmethacrylate （GMA）were grafted on inner and outer surfaces of modified silica,allowing brominated silica and CuBr / 2,2-pyridine to serve as macro-initiator and catalyst sys-tem. After hydrolysis,we got a hydrophilic reversed phase restrict access material with rich gly-col group, which was characterized by Fourier transform infrared （FT-IR ） spectrum,elementary analysis and thermogravimetric （TGA）analysis. The static adsorption experimentwas employed for evaluating the binding capacity of the novel reversed phase restrict accessmaterial. The maximum adsorption amounts of sulfadimethoxine and oxytetracycline were18. 02 and 4. 80 mg / g,respectively. The properties of material for the exclusion of proteins likebovine serum albumin （BSA）were evaluated using solid-phase extraction （SPE）and its exclu-sion value up to 90%. The novel reversed phase restrict access material was used for the separa-tion and enrichment of oxytetracycline in milk. The high-performance liquid chromatography（HPLC）was used to detect the oxytetracycline and the average recovery was 89. 19% with therelative standard deviation （RSD）of 3. 03%. It is expected that the novel inversed restrictaccess material combined with HPLC or liquid chromatography-mass （LC-MS）analysis systemis applied to the extraction and detection of biological samples.
　　
　　Key words:restrict access material;surface-initiated atom transfer radical polymerization.
　　
　　表面引发原子转移自由基聚合（surface-initiated atom transfer radical polymerization,SI-ATRP）是一种强大且灵活的合成技术，其适用的单体范围广，反应条件温和，分子设计能力强，可合成预定结构和序列的聚合物[1-3].Wang 等[4]通过反 ATRP 技术制备手性整体固定相，以 β-环糊精（β-CD）作为手性选择剂，采用 ATRP 技术在表面接枝亲水聚合物刷来提升柱的生物兼容性，将此材料结合 HPLC 检测血浆中的手性药物。Lv 等[5]通过逐层修饰成功制备了限进介质分子印迹磁性微球，用于磁性微萃取牛奶中的双酚 A,此限进介质分子印迹磁性微球选择性高，避免了生物样品中蛋白质在微球表面的沉积。
　　
　　限进材料是 20 世纪 80 年代[6,7]发展起来的一种用于生物样品直接进样的固相萃取材料。最初，Boos 等[8-10]提出烷基-二醇基限进材料（alkyl-diol-silica,ADS），并结合 HPLC 检测血浆、尿液等样品中的药物分子。喻昕等[11]提出了一种制备 ADS 固定相的改进方法。限进材料提供了以下优势[12-14]:第一，材料的亲水性外表面可以防止样品基质中的蛋白在表面发生不可逆吸附，延长使用寿命，减少成本；第二，材料内表面的配体可以变换不同的基团种类，如 C4、C8、C18或离子交换官能团等；第三，将新型材料与简便、多样及相容性较高的 HPLC 或 LC-MS 等分析系统相结合[15-17],为生物样品中药物残留检测提供了一条非常有前景的发展途径。Wang等[18]把 β-环糊精固定在硅胶内部，构建手性结合层，再通过 SI-ATRP 反应把甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝到表面，用该手性限进材料检测并拆分生物样品中的扁桃酸和氯噻酮。Wang 等[19]在硅胶表面引入十八烷基链和苄基氯，通过 SI-ATRP 接枝甲基丙烯酸环氧丙酯，水解得到表面含二醇基的反相限进材料，用于牛奶中邻苯二甲酸酯类物质的分离富集，但接枝十八烷基链没有采用 SI-ATRP 技术，以致单体接枝不够均匀，接枝密度不够高。
　　
　　甲基丙烯酸十八烷基酯[20]是具有 18 个碳的直链烷烃，但将其应用于限进材料的制备未见报道。近年来已有将 ATRP 技术用于制备限进材料的文献，但功能单体接枝量和接枝密度都有待提升。本文通过二步 SI-ATRP 技术在硅胶表面接枝两种不同的功能单体，接枝量高，接枝密度大。新型反相限进材料外表面的亲水层有效避免样品基质的干扰，对小分子具有萃取能力，但选择性不够高，有待继续研究。最后以新型反相限进材料为萃取基质，结合HPLC 检测牛奶样品中的土霉素（OTC）。
　　
　　1 实验部分。
　　
　　1.1 仪器、试剂与材料。
　　
　　LC-20AT 高效液相色谱仪、傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司），TU-1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Vario ELII元素分析仪（德国 Elementar 公司）。
　　
　　100 ~ 200 目硅胶（青岛海洋化工有限公司）；甲基丙烯酸十八烷基酯（纯度 96%,含质量分数为0. 01% 的氢醌-甲基醚稳定剂）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA,纯度 97%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（纯度 98%）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM,纯度 99%）、OTC（纯度 99%）、CuBr（化学纯）、2,2-联吡啶（纯度99% ）、2-溴异丁酰溴 （纯度 97% ）、牛血清白蛋白（BSA,纯度 98%）（上海晶纯试剂有限公司）；浓盐酸、浓硫酸、异丙醇、甲醇、三乙胺、乙二胺四乙酸二钠、四氢呋喃、甲苯均为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）；牛奶（购于当地超市，宁夏夏进乳业集团股份有限公司）。其他试剂均为国产分析纯。
　　
　　1.2 新型反相限进材料的制备过程。
　　
　　1.2.1 氨丙基硅胶（Silica-NH2）的制备。