一般在公共数据库中，如 NCBI、UCSC、Ensemble 给出的人类基因序列都没有对基因进行详细的标注。不过，有很多在线工具，可以预测和分析基因序列上的启动子、内含子、UTR区等（表 1）。
生物信息学的发展为在线软件预测基因启动子提供了众多有重要价值的参考信息[14]．通过生物信息学初步预测启动子相关信息和分析启动子序列及其调控元件，为深入研究启动子及确定其结构和功能奠定了基础[15]．唐亮等利用生物信息学技术预测人 TLR9 基因启动子区域、转录因子结合位点和 CpG岛分布[16]．Huang WL[17]等在 if．then 规则的基础上提出了一种新的预测人类和果蝇启动子的方法，并命名为 PromHD 方法。
3．2 酵母单杂交实验（Yeast One．Hybrid System）
酵母单杂交技术[18]是一种研究细胞内的蛋白质和 DNA 序列特异性相互作用的方法。GAL4 蛋白作为酵母单杂交系统中的一种典型的转录因子，其 DNA 结合域接近羧基端，包含多个锌指结构，可以激活酵母半乳糖苷酶激活位点（UAS），而上游的转录激活结构域能够与 RNA 聚合酶或转录因子 TFIID 交互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。在这个过程中，DNA 结合结构域和转录激活域可以完全独立起作用。因此，我们可以将 GAL4DNA 结合结构域以文库蛋白编码基因取代，一旦表达的蛋白质可与目的基因交互作用，一样能够通过转录激活结构域使RNA 聚合酶激活，启动下游报告基因转录[19]．酵母单杂交（Y1H）系统[20]是一个功能强大的工具，用来鉴定可以结合到目的 DNA 元件上的蛋白质，包括 cDNA 的转录因子[21],甲基化 DNA 结合蛋白[22]和 DNA 的复制起点[23]与端粒结合蛋白[24]．Y1H 系统与酵母双杂交系统（Y2H）在概念上相似，这是由 Field 和 Song[25]在转录激活蛋白的基础上发明的。此方法也在不断地进行改进。Deplancke[26]开发了互换兼容的 Y1H系统，不仅方便，高通量，而且可以无偏差地鉴定蛋白质 ．DNA相互作用。
酵母单杂交技术在启动子研究中得到了很好的应用。Li 等应用酵母单杂交筛选 11 个碱基库发现 TALEs 分别激活SCN9A 和 miR．34b[27]．通过酵母单杂交筛选，分离得到两个转录因子 IbNAC1 和 IbWRKY1,而且它们都与 SWRE（sporamin蛋白损伤响应元件）的调控序列的 sporamin 蛋白启动子片段进行交互作用[28]．在对拟南芥的研究中，酵母单杂交实验证明WRKY75 蛋白结合 CAPRICE 启动子[29]．在烟草叶本生中，EOT1 蛋白能够特异激活 SlTPS5 启动子[30]．酵母单杂交作为一种分子生物学技术[19],其过程简单，耗时短，能直接识别并定位顺式作用元件结合的蛋白及其编码序列，而不必用生化手段来纯化蛋白或抗体建立这种复杂的相互作用，并使得确定基因功能不再是一个艰巨的任务，从而更容易进一步理解在真核生物基因表达调控；而且酵母是真核细胞，在酵母体内研究与真核基因表达调控的实际情况接近，天然构象的蛋白也避免了体外研究的不足。Yan 和 Burgess[31]
开发了一种酵母逆单杂交系统，它使得快速和全基因组的转录结合靶标的鉴定成为可能。然而酵母细胞局限性在于自身因插入靶元件可能会与酵母内源性的表达激活因子发生相互作用，从而激活启动子下游报道基因的表达，这样相应的目的基因片段有可能会被漏检，Collart MA 等[32]提出该技术的灵敏度不高，HIS3 基因表达相当敏感，甚至对某些非特异性相互作用都能检测到，插入的靶元件可能无需转录激活因子的激活就能激活报道基因的表达，使假阳性克隆的比率得以提高。不过这些非特异的相互作用可通过设计其他技术避免。
3．3 染色质免疫共沉淀（ChIP）
染色质免疫共沉淀[33．35]是在生理条件下将细胞内的蛋白质与 DNA 进行交联并在活细胞状态下固定蛋白质．DNA 复合物，在超声波作用下将其随机切断成一定长度的染色质片段，然后沉淀该复合物，特异性富集目的蛋白结合的 DNA 片段，经过 DNA 纯化以及其鉴定，而获得蛋白质和 DNA 相互作用的信息。
利用该技术研究启动子目前通常用的是染色质免疫共沉淀 ． 芯片 （ChIP．chip） 和将 ChIP 与第二代测序技术相结合的ChIP．seq 技术。ChIP．seq 和 ChIP．chip[36]可以在全基因组范围内研究 DNA 和蛋白质的相互作用，进一步用于研究基因表达调控，这对于探讨各种生物过程具有重要意义。细胞内转录因子通过与核酸直接交互作用等方式起到了重要的转录调控作用。
它们通常特异性结合在转录起始位点上游的启动子区域，以调节基因的转录。ChIP 技术和启动子芯片的有机结合，能够确定任何一个特定转录因子靶基因群。
目前这两种技术应用也越来越广泛。Lee SB[37]等用 ChIP方法证实锌指蛋白 Nrg11 与体内葡萄糖抑制基因的特定启动子区域相互作用。Juneja M[38]等构建了一个启动子荧光素酶报告基因的载体，直接观察 MACC1 的转录从而鉴定 MACC1 启动子的作用。并且采用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀实验，证实这些转录因子与一个极其重要的 MACC1 核心启动子序列的物理性相互作用。ChIP．chip 和 Chip．seq 两种方法也可以结合来使用，Lei H[39]等同时采用 ChIP．seq 和 ChIP．chip 两种方法，对已知的研究得比较清楚的转录因子进行结合位点检测，产物强烈重叠的结果揭示了 HLH．1 优先与基因富集 E．box序列（CANNTG）的启动子区域结合。
ChIP 技术可以在体内反应；经过蛋白质 ． 蛋白质相互作用，直接或间接的识别基因组与蛋白质的相关位点；能够得到一个简单的图像在一个给定检验细胞环境的模式下。可是它需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；可能需要限制在组织来源中获取调控蛋白质的基因；想要得到高丰度的结合片段，必须在胞内条件下实验演示靶蛋白的表达情况。
3．4 瞬时转染法（Transient transfection）
瞬时转染[40]是在一定的转染程序下，将含目的调控区的质粒导入培养细胞。在典型情况下，调控区调控"报告基因"的转录。无论在 mRNA 水平还是在蛋白质水平上，报告基因是易于被检测到的基因，含报告基因的质粒在培养的细胞中转录，在某一特定时间对其合成的 mRNA 或蛋白质进行检测，用来评价调控区的活性。
瞬时表达系统是研究启动子功能及活性的重要手段之一。
由于在受体植物细胞内瞬时性表达的外源基因是游离于染色体之外的，因此，受体植物基因组对其产生的影响相对较小，其启动子活性基本反映了启动子本身的表达特性[41,42]．Zi C[43]等构建了 p．GL3 启动子的报告基因载体，瞬时转染 HEK293 细胞，证明了 FUT1 基因的启动子活性。利用瞬时性表达系统可以定性和定量地研究 CMV 启动子的表达活性。通过荧光检测法证明启动子可指导 GUS 基因的瞬时性表达[44],Li ZL[45]等构建了EGR1 启动子腺病毒穿梭载体，采用瞬时转染的方法研究 E．GR1 启动子对乳腺癌细胞辐照的敏感性的影响。
瞬时转染法优缺点：瞬时转染分析法快捷、简单，易于对结果定量，因此成为启动子功能分析的首选方法。瞬时转染分析法也有两个主要局限性：首先在被转染的细胞中，质粒的人工构象和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能；其次，瞬时转染分析法不能用于检测那些需诱导或分化时间超过 48~72 小时期限的研究。
3．5 凝胶阻滞分析实验（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率分析（Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA）[46,47]是一种研究 DNA 与特异性蛋白的交互作用的技术，起先用于研究 DNA 特异序列和相关的 DNA 结合蛋白的相互作用。当前它的使用已不限于 DNA 方面，可用于研究特定的 RNA 序列和 RNA 结合蛋白的相互作用，也可用于定性和定量分析 ．这种技术起源于对 rRNA 基因 ． 蛋白相互作用的早期工作[48,49],它广泛应用于细菌转录因子的研究。
凝胶迁移实验基本过程是[50],将 32P 标记或非放射性标记的包含特异的 DNA 位点的 DNA 片段与 DNA 结合蛋白共同孵育，Wolf SS 等也提出了用 33P 标记的 EMSA 的应用[51],蛋白 ．DNA 复合物通过非变性凝胶电泳能够与游离 DNA 分离开来，蛋白质阻碍与其所结合的 DNA 片段的移动性。因此，游离DNA 比 DNA． 蛋白复合物移动得更快，凝胶的图像可以揭示游离和结合的放射性标记的 DNA 的位置。现在由于健康、安全和环境问题，对非放射性检测的需求日益增加，在目前的研究中提出了非放射性标记的凝胶阻滞分析，并且可以研究蛋白质和启动子 DNA 序列的相互作用[52]．基于传统的 EMSA,Humphries[53]开发出了一些结合方法。
采用竞争性电泳迁移率变动分析方法鉴定了一种以前未报道过的干细胞核因子 3 位点，它提供了低成本但是高通量的辅助工具，使用未标记的 DNA 竞争阵列鉴定不确定 DNA 结合蛋白。凝胶电泳阻滞分析在分析化学中起重要作用，比如定量生物科学和即时检验分析。Jiang X 等[54]用 EMSA 方法证明了AP1 能够结合在启动子的功能区域，并且调控人 LoVo 细胞的PPARdelta 的表达。
Katanin 是参与微管切断 ATP 酶家族成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由 KATNA1 和 KATNB1编码，而 Elk1 能够与微管相互作用，Sel觭uk E 等[55]用 EMSA 方法证明 Elk1 能够结合 KATNB1 启动子，调控其表达。凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活 PXR 与 CYP3A4DNA 结合的能力，表明 CYP3A4 的诱导是由青蒿素通过 PXR 的活化所介导[56]．凝胶电泳阻滞分析方法分析了肝 X 受体基因 NR1H3 启动子多态性[57]．EMSA 本身有很多不足，如不同片段之间亲和力大小难以比较；不能鉴定蛋白复合体与 DNA 的结合；低亲和力结合很难识别；鉴于体外环境和体内环境存在巨大差异，EMSA 难以真正重建蛋白质和 DNA 之间在体内的结合过程。 因此有必要对 EMSA 技术进行改进或开发更好的蛋白质和 DNA 相互作用的技术。也常采用与其它方法结合联合验证。Aung KM 等人采用传统的 EMSA 和荧光各向异性 （FA） 以及以一个金粒子（AuNPs） 为基础测定法，来研究 DNA 结合 FOXA1 和 FOX．A1．DNA 的配体干扰的性质[58]．EMSA 操作过程中使用的丙烯酰胺溶液有毒，所以 Vanek PG 等人利用 TreviGel500,一种无毒的能替代聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移分析[59],但是 Tre．viGel500 比较贵，用起来不实惠。
3．6 DNase I 足迹法（DNase I footprinting）
DNase I 足迹法是一种定位蛋白质结合 DNA 的特异性结合位点的技术。先将含有特定顺式元件的双链 DNA 片段进行单链末端标记，然后加入恰当浓度的 DNase I,对 DNA． 蛋白质复合物进行酶切，形成了不同长度的 DNA 片段，最好使其相邻的 DNA 片段只差一个核苷酸，然后片段经变性后 PAGE 电泳分离，放射自显影，便可形成只有一个核苷酸差异的 DNA 梯形带。假如 DNA 片段与相应的序列特异性 DNA 结合蛋白结合，结合蛋白保护磷酸二酯骨架免受 DNA 酶 I 催化水解，周围的结合蛋白阻止 DNA 酶结合其结合位点，因而在放射自显影图谱上，间断的结合区域，就会产生分裂梯"足迹",于是被形象地称作足迹法。DNase I 由于空间位阻不能绑定直接相邻的 DNA结合蛋白，因此，足迹特征比较明显，一般比自身位点大 8~10（bp）个碱基对。
Brenowitz 等[60]介绍了用足迹法定性鉴定粗提取物中 DNA结合蛋白。Carey MF 等[61]在前人的基础上就 DNase I 分析方法的具体操作步骤作了详细描述。DNase I 也是最常用的核酸酶[62].如果同时进行 DNA 化学测序，即可判断出结合区的精确顺序。DNase I 足迹法常与凝胶阻滞分析联用，用于鉴定结合在基因调控区序列上的核因子。Wang L[63]等用 EMSA 和 DNA 足纹分析方法发现 NicR2 直接与 nic2 启动子区的一个 28 bp 的反向重复序列（IR）发生相互作用，揭示尼古丁降解假单胞菌中的转录调控，表现了复杂的原核转录调控的一个新的水平。日本科学家 Ikeda Y[64]等用 EMSA 和 DNase I 足迹法分析了来自热源体的 Thermoplasma volcanium 的转录因子如何结合自身启动子，并证明其结合依赖二价铁离子。
