引言
【研究意义】肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是一种在肌细胞生成过程中能抑制骨骼肌生长和发育的负向调控因子，通过调控成肌细胞的增殖来影响肌肉的生长与发育；此外，MSTN对脂肪沉积和骨骼的生长发育也有调节作用，甚至还能影响肌腱和韧带的强硬度（任磊，2007；岳敏，2008；张柯，2010）。因此，深入了解MSTN在猪肌肉生长发育和脂肪沉积方面的功能，揭示动物生长发育机理，对通过调节MSTN基因表达来调控畜禽肌肉生长发育和脂肪沉积，以达到调控畜禽肉品质、机体膘情等具有重要意义。【前人研究进展】MSTN是McPherron等（1997）在研究TGF-β超家族基因时所发现的。发展至今，已分别从猪（Ma et al.，1997）、牛（冀德君等，2008）、羊（李锐等，2010）、大黄鱼（Pan et al.，2007）等动物中克隆获得MSTN基因。国内有关猪MSTN基因的研究也有大量报道。王世凯等（2007）克隆获得广西巴马小型猪MSTN基因cDNA序列长度为1128 bp，其与GenBank报道的猪MSTN基因cDNA序列同源性高达99.7%，共有3处存在碱基突变（两个为同义突变，一个为错义突变）。任磊（2007）利用PCR-SSCP分析藏猪MSTN基因3个外显子的多态性，并利用计算机网络技术和生物信息学方法比较分析藏猪MSTN基因编码区序列特点，其结论为合理利用藏猪的优良遗传资源提供了理论依据。岳敏（2008）通过研究西藏小型猪MSTN基因多态性及其生长发育特性，发现西藏小型猪MSTN基因表现出3种基因型TT、AA和TA，等位基因T和A的频率分别为23.81%和76.19%。邢慧君等（2012）研究表明，鲁莱黑猪MSTN基因5'调控区的435、447和879位点存在多态性，检测到435A-447G-879T（A）、435G-447A-879T（B）、435A-447A-879A（C）和435A-447A- 879T（D）4种单倍型，依据其遗传效应，提高B和A单倍型频率有望提高鲁莱黑猪的生长速度，而提高C单倍型频率可保持鲁莱黑猪的优质和高繁特性。刘晓琴等（2013）对长白猪、大白猪、杜长大、通城猪、莱芜猪、五指山猪的MSTN基因进行多态性检测及生长性状关联分析，发现MSTN基因P4和P5两个位点的多态性与猪生长性状显着相关。【本研究切入点】陆川猪是中国八大地方优良猪种之一，也是广西具有地方特色的畜禽品种，因其具有肉质细嫩多汁、香味浓郁等特点而广受消费者青睐（谢栋光和丘立天，2003；黄雅琼等，2013）。目前，国内已有一些学者对陆川猪的肉质性状等表观指标进行了初步探索（张家富等，2010；何若钢等，2011），但鲜见从分子生物学角度对陆川猪优良肉质性状形成的机制进行探讨。【拟解决的关键问题】通过克隆陆川猪MSTN基因，分析碱基突变等变化情况，为后期开展MSTN基因表达与陆川猪肌肉生长发育及脂肪沉积的相关性研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验用猪为6月龄的广西陆川猪，由广西畜牧研究所种猪场提供，宰杀后采集其背最长肌的肌肉组织。Trizol试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨购自英国OXOID公司；感受态细菌购自北京全式金生物技术有限公司；DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒、DNA片段回收纯化试剂盒购自BioFlux公司；M-MLV反 转 录 酶 、Taq DNA 聚 合 酶 、pMD18-T 载 体 购 自TaKaRa公司。
1. 2 引物设计与合成
参考GenBank中已发表的猪MSTN基因序列（NM_214435），利用Oligo 6.0软件设计1对特异性引物，上游序列：5'-ATGCAAAAACTGCAAATCTATG-3'；下游序列：5'-TCATGAGCACCCACAGC-3'，扩增片段大小约1128 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1. 3 总RNA提取
采用传统Trizol法提取广西陆川猪肌肉组织总RNA，利用分光光度计检测RNA纯度，电泳检测RNA完整性。用TaKaRa公司的反转录试剂盒对总RNA进行反转录合成cDNA。反转录体系为20.0 μL，其中总RNA 3.0 μL，5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，dNTPs（10mmol/L）2.0 μL，RNA 酶抑制剂 0.5 μL，Oligo（dT）18（2.5 μmol/L）1.0 μL，M-MLV反转录酶1.0 μL，DEPCddH2O 8.5 μL。 反应程序为：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5mim，5 ℃ 5 min。然后将转录产物置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1. 4 RT-PCR扩增
以反转录产物为模板进行PCR扩增，反应体系为20.0 μL，即模板4.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃100 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 5 克隆及序列分析
RT-PCR扩增产物纯化回收后与pMD18-T载体连接，然后转化DH5α感受态细胞，再将菌液涂布在含有氨苄青霉素（Amp+）的LB固体培养基上，37 ℃培养，待菌液完全吸收后（约30 min），将培养基倒置，培养过夜，次日观察细菌生长情况。挑取单克隆在含Amp+的LB液体培养基中培养，然后利用Cracking鉴定，并用普通质粒小提试剂盒提取重组质粒，将含有目的片段的重组质粒送至北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司进行测序。测序结果用Lasergene 7.0软件进行序列分析，用MEGA 6.0软件进行同源性比对，并用在线蛋白质结构分析软件Protein Model Portal（PMP）预测陆川猪MSTN蛋白质二级结构。
2 结果与分析
2. 1 陆川猪MSTN基因克隆
提取陆川猪背最长肌总RNA并反转录成cDNA，应用设计的特异性引物，经RT-PCR扩增获得特异性条带，片段大小在1000~2000 bp（图1），与预期序列长度1128 bp相近，条带清晰。
2. 2 陆川猪MSTN基因序列分析结果
陆川猪MSTN基因阳性克隆经测序得到1128 bp的核苷酸序列。该核苷酸序列与GenBank已公布的普通猪（NM_214435）MSTN基因编码区序列（CDS）的同源性为99.8%，与外来品种约克夏（Yorkshire，AF188638）、汉普夏（Hampshire，AF188636）、杜洛克（Duroc，AF188635）的同源性均为99.9%；与地方品种梅山猪（AF188637）、藏猪（EF612791）、广西巴马小型猪（JN630464）的同源性分别为99.9%、99.8%和99.8%。
序列对比分析结果表明，陆川猪MSTN基因CDS与其他品种猪相比，存在第294位点的A→G（图2），碱基G为陆川猪所特有，但碱基突变未引起氨基酸改变。此外，与普通猪（NM_214435.2）相比，陆川猪MSTN基因CDS还存在第920位点G→A，为错义突变，导致丝氨酸突变为天冬氨酸；与广西巴马小型猪相比，陆川猪MSTN基因第39位点发生C→T，为无义突变；与藏猪相比，陆川猪MSTN基因第71位点发生C→A，导致苏氨酸突变为天冬氨酸。【图1-2】
2. 3 MSTN基因系统进化树构建
将获得的陆川猪MSTN基因序列进行BLAST分析，结果显示，该序列与约克夏猪（Yorkshire，AF188638）、马（Equus caballus，NM_001081817）、人（Homo sapiens，NM_005259）、食蟹猴（Macaca fascicularis myostatin，NM_001287623）、绵羊（Ovis aries，NM_001009428）、牦牛（Bos grunniens，EU926669）、狐狸（Vulpes lagopus，FJ966249）和小鼠（Mus musculus，NM_010834）的同源性分别为99.9%、97.1%、95.7%、95.7%、94.6%、94.1%、92.3%和91.9%。根据上述物种MSTN基因的碱基同源性构建物种系统进化树（图3），发现广西陆川猪与约克夏猪的遗传距离最近。【图3】
2.4 陆川猪MSTN蛋白二级结构预测结果
利用在线蛋白质结构分析软件Protein ModelPorta（lPMP）预测陆川猪MSTN蛋白质二级结构，结果如图4所示，陆川猪的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件。【图4】
3 讨论
MSTN对动物骨骼肌生长具有重要的调节作用（Lee and McPherron，1999），能够负向调控肌细胞的生长发育。近年来，MSTN基因在畜禽肉质方面的研究取得了一定进展，被认为是影响畜禽肉质性状的主要候选基因之一。Grobet等（1997）研究发现，牛MSTN基因发生突变会引起“双肌”特征，即肌肉过度肥大或肌肉纤维数量增加。张珂（2010）研究表明，MSTN基因可作为影响家兔部分屠体性状的候选基因，其外显子1的194 bp和外显子2的445 bp碱基突变可能是兔屠体性状（全净膛重、屠宰率和熟肉率）辅助选择的遗传标记。在深入了解MSTN基因对肌肉生长发育负调控作用的基础上，科学家们期望通过阻断MSTN基因在体内表达来改善肌肉的生长发育，为畜禽育种开辟新途径。
本研究克隆的陆川猪MSTN基因CDS与约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8%以上，说明猪MSTN基因高度保守，在调控猪遗传性状稳定性方面起重要作用。此外，本研究发现陆川猪MSTN基因第294位点存在特有的碱基G，该突变未引起氨基酸改变，但是否影响基因表达有待进一步探究。从基于MSTN基因碱基同源性构建的物种系统进化树可以看出，两个品种猪聚为一支，人与食蟹猴聚为一支，即进化树的拓扑结构与物种之间的遗传关系相符。猪的MSTN蛋白是由375个氨基酸残基组成，其中1~23为信号肽，24~266为前肽，267~375为成熟肽（姜声旺等，2012）。本研究利用PMP软件预测陆川猪的MSTN成熟肽为270~375位氨基酸，且包含4种标准的蛋白质二级结构元件。序列分析结果表明，不同品种猪的MSTN成熟肽区未发现氨基酸差异，进一步证实MSTN基因比较保守。
可见，MSTN基因可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一，弄清MSTN基因序列对深入了解陆川猪优良肉质性状形成的分子机制具有重要意义，也可为今后研究MSTN基因在陆川猪骨骼肌中的表达规律及其与肌肉生长发育、脂肪沉积的相关性等奠定基础。
4 结论
本研究克隆的陆川猪MSTN基因CDS与约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8%以上，虽然陆川猪MSTN基因第294位点存在特有的碱基G，但未引起氨基酸改变。可见，猪MSTN基因高度保守，可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一。
