苔藓植物能够促使沼泽陆地化，储蓄土壤水分，是其它陆生植物生长的开路先锋者。东亚砂藓（Racomitrium japonicum）属于紫萼藓科（Grimmiace）砂藓属（Racomitrium）植物，松散或密集丛生,主要生长在岩石表面的薄土和砂土上，因其具有极强的抗旱性而成为国内外研究的热点。其中质膜蛋白在水分胁迫下的变化与其抗旱性有着密切的关系，当苔藓受到干旱胁迫时，细胞膜的保护酶会构成防御系统，对抗逆境对细胞内部的伤害，因此，细胞质膜的提取将是苔藓植物抗旱机理研究的重要一步。
植物细胞质膜不仅是细胞与环境间物质交换与信息传递的重要场所，且介导不同类型细胞的水分运输，对水分的跨膜转运及抗旱过程起着重要的作用。其中细胞质膜蛋白的分离是研究质膜对水分运输作用的必要前提，目前，人们使用较多的质膜分离方法包括蔗糖密度梯度离心法和水双相分配分离法，两者的区别在于蔗糖密度梯度离心法是通过膜囊泡的大小和密度进行分离，而水双相分配分离法是依据膜表面的特性进行分离。后者对实验的外界条件要求较高，操作复杂，且不易出结果。而传统的水通道蛋白分离方法是通过研磨破碎细胞组织，将细胞组织粗提液放在不同密度梯度的蔗糖匀浆液中离心、悬浮，从而得到细胞质膜蛋白。本实验通过对传统蔗糖密度梯度法的改进，使其操作相对简便，样品浓度提高且实验成本降低，是一种更为高效、快速的质膜蛋白分离方法。
1、 材料与方法
1.1 实验材料
东亚砂藓植物于 2011 年采自五大连池风景区。
1.2 实验试剂
EDTA、DTT、PMSF、PVPP、Na2CO3、SDS、TEMED、过硫酸铵、蔗糖等。
1.3 实验设备
冷冻高速离心机、冷冻超速离心机、电泳仪、摇床、漩涡震荡器。
2、 实验方法
2.1 质膜蛋白粗提物的制备
将两份相同质量的材料洗净，一部分干旱胁迫，一部分正常培养 3d，分别取茎尖约 5g 放入预冷的研钵中，加入 0.3gPVPP，液氮中快速研磨至细粉末（研磨 40min 左右）。将粉末移入 30mL 离心管中，每管加入 15mL 预冷的匀浆液（匀浆液：50mL 匀浆液中加入 0.5mol·L-1EDTA0.2mL，0.5mol·L-1Tris5mL，1mol·L-1蔗糖 12.5mL，1mol·L-1DTT1mL，0.2mol·L-1PMSF0.25mL），漩涡器震荡混匀。置于 4℃离心机中，转速12000r/min（8000g）离心 15min，小心吸取上清液至新的离心管中，同样转速离心 15min，吸取上清液，再次离心，收集的上清液即为质膜蛋白粗提液。
2.2 质膜蛋白的分离
用 4℃超速冷冻离心机将膜蛋白粗提液以 100 000 g 的速度离心 1 h，弃去上清液，以预冷的 0.1mol·L-1Na2CO3溶液洗涤沉淀。玻璃匀浆器冰上匀浆 1min 后放入冰上静止 20min，再置于超速冷冻离心机100 000g 离心 1 h。重复上步洗涤过程，弃上清，每管加入半浓度的匀浆液 30 mL（半浓度匀浆液：50 mL匀浆液中加入 0.5mol·L-1EDTA0.1mL，0.5mol·L-1Tris2.5mL，1mol·L-1蔗糖 6.25mL，1mol·L-1DTT0.5mL，0.2 mol·L-1PMSF0.12 mL）。重悬沉淀，匀浆器充分匀浆。100000g 超速离心 1h，弃上清，将沉淀悬浮于 500μL0.05mol·L-1Tris 溶液中。匀浆器匀浆，分装保存于-20℃。
2.3 SDS-PAGE 凝胶电泳
利用变性不连续SDS-PAGE凝胶电泳方法对质膜蛋白的分离进行分析，配方如表1。待胶板凝固后，每个点样空加入40 μL样品和5μL溴酚蓝指示剂混合液，开始电泳。调节电压为130V，电流为50mA，大约2h，溴酚蓝指示剂到达距低端1~2cm处时，终止电泳。将凝胶板取出，放入考马斯亮蓝染色液中染色1h，轻轻取出胶板置于脱色液中脱色12h，照相观察。
3、 实验结果
质膜蛋白粗提物制备过程中的一个重要步骤是组织匀浆液的选择，其中，Yoshida等人在匀浆液中加入了0.01mol·L-1乙二醇四乙酸（EGTA），本实验以0.5 mol·L-1EDTA作为代替，EDTA与金属离子形成配合物的稳定性较强，可以更大程度地减少对磷脂酶的毒害作用。其次，Tris溶液是广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,可除去水溶性的杂质(多糖类，核酸等)，也是质膜蛋白的溶解剂。为了抑制蛋白酶和脂加氧酶的活性，本文加入了0.2mol·L-1PMSF溶液，抗氧化剂DTT和酚类物质吸附剂PVPP，作用是减少植物中酚类物质氧化造成的干扰，尽量保证在制备膜蛋白粗提取物中的酶和蛋白的活性不受影响。
本实验通过对蔗糖密度梯度法的优化，成功分离浓度较高的东亚砂藓质膜蛋白，如图 1 所示，在 28kDa 处有条清晰可见的条带，表明无论是正常生长的东亚砂藓材料，还是干旱胁迫后的材料都可以从膜蛋白上分离出水通道蛋白，且分离的水通道蛋白含量较高，浓度较大，可以用做 Western Blot 蛋白表达分析及蛋白质组学等后续试验。
4、 讨论
植物质膜蛋白在细胞转录水平、水通道蛋白的膜运输、转录后水平等多方面都起到调控作用，例如植物气孔的开闭，细胞膨压，种子萌发、栓塞修复等都需要质膜蛋白的参与。此外，植物的逆境胁迫响应（如干旱、低温、盐分）也与许多质膜蛋白有密切关系，李勤报等研究发现小麦的根部及叶片在干旱胁迫下ATPase分解的活性升高，过氧化物酶活性升高，有利于植物在逆境中生存。
如今，质膜蛋白已在分子方面进行了大量的研究，而蛋白质组方向的研究相对较少，主要原因包括质膜蛋白的分离比较困难，因此，对其分离方法的优化将有助于细胞质膜蛋白在表达调控等方面的进一步研究。
主要的植物质膜蛋白分离方法包括蔗糖密度梯度离心法和水双相分配分离法，其中水双相分配分离法中两相体系的组分、分配条件和操作步骤等不同制备条件以及不同的植物材料对质膜的分离效果都会有较大的影响。蔗糖密度梯度离心法相比之下，操作简便，纯度较高。但传统的蔗糖密度梯度离心法需要制备蔗糖梯度，颗粒在两种不同浓度梯度中的扩散是不可避免的，且加样和离心时梯度易被破坏，因此本实验在以下几个方面对蔗糖密度梯度离心法进行了改进。
（1）研磨材料时，将材料放在预冷的研钵中，液氮下充分研磨置粉末，若细胞破碎不彻底,将影响细胞膜蛋白的分离。
（2）传统的蔗糖密度梯度离心法用四层纱布过滤后离心，不仅会有少数膜蛋白流失，同时膜蛋白的提取过程中要尽量保持低温，纱布过滤会影响匀浆液的温度，对膜蛋白产生影响。我们采用振荡器充分震荡，经过 3 次低温低速离心，除去杂质，保留浓度较高的膜蛋白粗提物。
（3）匀浆液的选择是分离膜蛋白的重要步骤之一，本实验采用了浓度较高的 EDTA 代替 EGTA，减少了对磷脂酶的毒害性，同时，加入了 PMSF、DTT 等抗氧化剂以减少蛋白粗提物中对酶和蛋白活性的影响。
（4）传统的蔗糖密度梯度离心法将膜蛋白粗提液铺在两种不同浓度的蔗糖溶液上，加样和离心过程中粗提液易扩散，从而破坏蔗糖梯度，所以本实验用带有蔗糖的匀浆液进行膜蛋白粗提物的提取，再用半浓度的匀浆液分离水通道蛋白，如此避免了梯度离心对水通道蛋白分离产生的影响。
植物细胞质膜蛋白是近年来蛋白质组学研究的一个热点。通过对蔗糖密度梯度离心法的优化，使质膜蛋白最大程度的释放出来，减少了细胞质蛋白的污染，同时，本实验室已利用该方法成功提取丁香水通道蛋白，条带清晰，且浓度较高，说明该方法重复性好，可用于其它植物的水通道蛋白的分离。为水通道蛋白质的进一步研究奠定基础。
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