非编码 ＲNA 在基因调控方面有着重要功能，可广泛参与基因调控的各个层面，在发育、癌症、神经功能紊乱等生物过程中都发挥重要作用［1］。在长非编码ＲNA 中有一重要亚类，天然反义转录本，是从已知转录序列的互补链转录的转录物［2］。有学者提出一些分子模型来解释天然反义 ＲNA 产生功能的分子机制，如转录干扰、ＲNA 遮蔽、双链 ＲNA 降解、翻译干扰等［3］。已经有研究表明，长非编码 ＲNA 与转录因子的编码基因有着更密切的联系［4］。Dlx1as 是众多天然反义 ＲNA 中较早被发现的，但到目前为止，关于其具体生物学功能的报导很少。Dlx1as 在基因座位上位于进化上极其保守的两个转录因子 Dlx1 与 Dlx2之间［5-6］。Evf 2 作为 Dlx1 同源蛋白 Dlx5-Dlx6 基因座位中的天然反义转录物，已被证实可以反式调节另一个同源基因 Dlx2［7］。本研究以小鼠的大脑发育为模型，检测与探讨了 Dlx1as 在发育过程中的表达，分析 了 其 对 Dlx1 编 码 基 因 产 生 影 响 的 可 能机制。
一、材料和方法
材料 pGEM-T 载体、质粒提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒购自天根生化科技 ( 北京) 有限公司，反转录试剂盒购自全式金生物科技公司，实时定量 PCＲ 试剂盒、ＲNase-Free DNaseI 购自日本 Takara 公司，Trizol购自美国 Invitrogen 公司，T4 DNA 连接酶购自美国Promega 公 司。 E12. 5、 E14. 5、 E16. 5、 E18. 5、 P1、P7 及成年小鼠品系均为 ICＲ 品系，由中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心饲养。冰冻切片机为莱卡 CM1950 ( 实验室器材) 。
组织 ＲNA 的提取及去 DNA 处理 取新鲜鼠脑组织，按照 1 mg 组织∶1 ml 的比例加入 Trizol，使用高速匀浆器进行破碎，之后加入 200 μl 氯仿抽提，4℃12 000 r / min离心 20 min; 吸取上清 500 μl，加入等体积异丙醇，4℃放置 1 h，4℃ 12 000 r/min 离心 20 min;弃上清，75% 乙醇 1 ml 漂洗 2 次，晾干，加入适量DEPC 水溶解。按照 10 μg 总 ＲNA 加入 10U DNaseⅠ与相应体积的 10 × buffer，37℃反应 30 min，70℃热失活 5 min。
ＲT-PCＲ 使用 2 μg 总 ＲNA 作为模版，1 μl( 50 pm) OligdT 作为引物，2 × buffer 10 μl、反转录酶1 μl、DEPC-水补足 20 μl 体系。阴性对照的 PCＲ 体系中未加逆转录酶。
实时定量 PCＲ 用等量 cDNA 作为模版，20 μl总体系，0. 5 μl-Primer-F，0. 5 μl-Primer-Ｒ，10 μl-2 ×Mix，使用 GAPDH 为内参，对 Dlx1 mＲNA 与 Dlx1as 进行定量检测。实时定量 PCＲ 引物序列见表 1。
克隆与测序 将 ＲT-PCＲ 得到的特异条带进行切胶回收，用 DNA 纯化试剂盒纯化，将纯化的 DNA 产物连接到 pGEM-T 载体，连接产物转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，菌落 PCＲ 鉴定阳性克隆，接菌，送美国 Invitrogen 公司测序部进行测序。
ＲNA 探针制备 使用将 Dlx1as 与 Dlx1 mＲNA 的片段克隆到 pGEM-3Zf 载体，分别使用 BamHⅠ与 HindⅢ进行线性化，醇沉回收线性化质粒，使用 T7 转录酶体系进行体外转录，ＲNase-Free DNaseⅠ消化模版，醇沉，漂洗，50μl DEPC-水溶解，加入等体积甲酰胺，标定浓度为 50 ng/μl，分装使用。
原位杂交 使用冰冻切片机，将不同天数的鼠脑进行切片，使用杂交液进行预杂交，使用0.5 ng/μl 的终浓度探针，65℃ 杂交过夜，使用 0. 2 × SSC，65℃，洗脱20 min，重复 3 次，使用地高辛抗体 1∶ 5000，4℃ ，杂交过夜，进行显色反应，中性树脂进行封闭保存。使用尼康显微镜进行拍照记录。
二、结 果
Dlx1as 分子具有多聚腺苷酸尾 使用 UCSC 公共数据库的 polyA 信号分析，在 Dlx1as 的末端有 1 个强烈的特征信号，强度比 Dlx1 mＲNA 更高; 采用 OligdT和 Ｒandom primer 进行反转录，以得到的 cDNA 为模版进行 PCＲ 扩增，阴性对照未见条带，目的片段大小符合预期，连接 pGEM-T 载体，测序正确 ( 图 1) 。
Dlx1as 和 Dlxl mＲNA 在小鼠大脑胚胎期高表达Dlx1as 和 Dlx1 mＲNA 在神经发育过程中出现了一段时间 内 的 高 表 达，从 E14. 5 持 续 到 E18. 5，除 在E12. 5 和成年小鼠中有显著性差异外，其余 4 个时间点均没有显著性差异。使用曲线拟合，计算得出 Ｒ2=0. 71 ，P = 0. 19 ( 图 2) 。
Dlx1as 与 Dlx1 mＲNA 在空间表达上具有互补性从 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的时间点中，都能够看出二者的表达部位有明显的差别，虽然二者均较特异表达于大脑腹侧生发区，但 Dlx1 mＲNA 在室周区较室周下表达量更高，而 Dlx1as 则与之相反 ( 图 3) 。
三、讨 论
越来越多的证据表明，一些长非编码 ＲNA 的转录使用和 mＲNA 相同的转录机器，具有多聚腺苷酸尾，有可变剪切形式。本研究鉴定了经典的天然反义ＲNA—Dlx1as 具有多聚腺苷酸尾。在特定的时空表达的ＲNA 分子，很可能会参与特定的生物学过程。Dlx1as在小鼠胚胎期大脑中高表达，与成年的低表达形成鲜明的对比，揭示 Dlx1as 很可能在大脑发育过程成具有重要功能。而且 Dlx1as 与 Dlx1 mＲNA 的表达趋势非常类似，笔者认为可能是整个基因座位的转录被激活所导致，当然也不能排除二者的转录分别受到调控，还需要进一步的验证转录的上游控制。
天然反义 ＲNA 很多都通过影响 mＲNA 来产生效应，例如天然反义 ＲNA Star 的表达可以降低 StAＲ 的蛋白表达，在体敲低 Bdnf-AS 的表达水平，可以使 Bdnf 的表达水平得到大幅度的增强［8-9］。因此笔者推测 Dlx1as 很可能也是通过类似方式来实现其功能的。本研究通过原位杂交，发现 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的胎脑中，在脑室室周，Dlx1as 与 Dlx1 mＲNA 有着明显的位置不同，甚至是接近互补的存在，由此推测 Dlx1as 可能是通过对 Dlx1 mＲNA 的负调控来发挥功能的。在笔者撰写文章的同时，有新加坡的实验室发表了关于 Dlx1as 敲除小鼠的研究，并提出了Dlx1as 通过负向调节Dlx1 mＲNA的分子模型，与笔者推测相符［10］。至于更加详细的分子调控机制，还需要进行更加深入细致的研究。
参 考 文 献
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