猪盖塔病毒的病原学分析与复制机制

　　摘    要：　盖塔病毒（Getah virus, GETV）属于披膜病毒科甲病毒属。GETV属于虫媒病毒，可以通过蚊虫感染低等脊椎动物。猪群感染GETV后可发生轻微症状，主要导致怀孕母猪繁殖障碍。目前，GETV在世界范围内流行较为广泛，近年来逐步在猪群中暴发，导致部分猪场经济损失严重。因此，加强对猪源GETV的病原、致病机制和疫苗的研究，对于该病的防控具有更重要的意义。本文对猪源GETV分子结构和病毒复制以及近年来研究进展进行了综述和展望。

　　关键词：　盖塔病毒; 基因组; 结构蛋白; 病毒复制;

　　Abstract：　GETV, which is a famiy the genus Alphavirus in the family Togaviridae. GETV belongs to a type of arbovirus that can infect lower vertebrates by mosquitoes. Mild symptoms may occur in pigs infected with GETV, which mainly leads to reproductive disorders in pregnant sows. Currently, GETV is widely prevalent in the world, and has been gradually erupting in pig herds in recent years, resulting in severe economic losses in some pig farms. Therefore, it is of more significance to strengthen the pathogenic mechanism and vaccine research of swine gaeta virus for the prevention and control of the disease. In this paper, the molecular structure and virus replication of pig-derived gaeta virus and the recent progress of the research are reviewed and prospected.

　　Keyword： GETV; genome; structural protein; viral replication;

　　盖塔病毒（Getah virus, GETV）属于披膜病毒科，甲病毒属。GETV分布的地理区域比较广泛，从欧亚大陆一直延伸到大洋洲，涉及到的宿主较为广泛。盖塔病毒主要感染猪和马，病毒感染怀孕母猪后，可导致怀孕母猪胎儿死亡和流产等繁殖障碍症状，盖塔病毒已被证实是引起母猪繁殖障碍的病原因子之一[1]。近年来我国多个省份猪场出现盖塔病毒疫情，并造成一定的经济损失。

　　1 、盖塔病毒概况

　　盖塔病毒是一种由蚊虫传播的病毒，分类学上属于披膜病毒科甲病毒属。GETV于1955年在马来西亚首次从库蚊中分离出来[2]。随后GETV先后在日本、澳大利亚、马来西亚、中国、韩国和东北亚被报道，1964年我国海南省首次从蚊虫中分离到GETV，随后GETV在中国广泛而迅速地传播，病毒已从河北、海南、四川、甘肃和上海等几个省的蚊子和牲畜中分离出来。目前，已有研究报道了GETV感染马和猪的临床症状，GETV感染马匹后可引起短暂的发热、皮疹和腿部水肿[3,4]；GETV感染猪只后可引起发热、厌食症、抑郁和腹泻，并可导致胎儿死亡和生殖障碍[4,5]。有研究报道，在鸟类、牛、山羊等其他动物血清中也能检测到GETV抗体[6,7,8,9]。日本科学家证明了感染GETV的猪能够很快产生病毒血症，因此猪群在自然界中被认为是GETV的主要放大宿主[10]。
 

　　2、 盖塔病毒病原学

　　2.1、 GETV基因组结构

　　甲病毒的基因组为单链RNA，基因组全长约11 400～11 800 nt，盖塔病毒全基因组长度约为11～12 Kb，其中在基因组的79～7482位点编码病毒非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3、nsP4），基因组的7527～11 288位点编码结构蛋白（C、E3、E2、6K、E1）。

　　盖塔病毒粒子呈球形，直径约50～70 nm，有囊膜及纤突。盖塔病毒基因组是典型的甲病毒属基因组结构，盖塔病毒属于单股正链RNA病毒。其基因组RNA 5’端具有甲基化的帽状结构，3’末端具有ploy(A)的尾巴结构，编码两个均匀排列的开放阅读框（open reading frames, ORFs）。5’端的ORF编码4个非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4），3’末端的ORF编码5种结构蛋白，包括C蛋白、E3蛋白、E2蛋白、6K蛋白、E1蛋白[11]。

　　甲病毒含有一个二十面体的核衣壳，被包裹在一个紧密的包膜中，其糖蛋白成分存在于二十面体晶格中[12]。核衣壳是由病毒的单股正链RNA基因组与多个30 kDa的单一衣壳蛋白装配而成，其二十面体具有对称性和开孔结构，使得衣壳内的RNA很容易被RNase降解。同时，病毒的核衣壳在受感染细胞的细胞质中组装成不同的受体，其中衣壳蛋白分子组合与包装信号结合，更多的衣壳蛋白被招募到结构中，这一反应可能与部分组装壳层中已经存在的蛋白横向互作。衣壳蛋白的N端与病毒RNA之间也存在静电作用。N端的结构域与RNA的静电结合可能是非特异性的，不需要特定的蛋白质结构，这个区域的电荷密度非常高，这可能是导致空壳无法组装的原因，因为组装可能需要中和这些电荷。相反，与其他衣壳蛋白的横向相互作用可能是特异性的，并由蛋白保守的C端序列介导衣壳的组装，具有一定的特异性。

　　图1 病毒粒子结构和结构蛋白[13]  

　　Fig.1 Virion structure and structural proteins[13]

　　A: Sindbis病毒的表面阴影图像,分辨率为9A,从二十面体双轴向下观察; 蓝色为花状三聚体穗状体，绿色为脂质双分子层的一小部分; B: 病毒粒子的中心横截面显示粒子的组织与糖蛋白(蓝色), 裙子的信封(青绿色)的脂质双分子层(绿色)渗透跨膜螺旋的糖蛋白, 下令蛋白酶域的衣壳蛋白(黄色), 无序蛋白质的RNA区域(橙色)和RNA区域(红色); C: 9个A结构中208 A处的径向切片, 显示核衣壳核在下面的二十面体二重轴处; D: Semliki森林病毒包膜蛋白E1单体构象的结构(蛋白数据库鉴定[PDB ID]: 2ala). 根据方案DI: red对域(DⅠ、DⅡ、DⅢ)进行着色; DⅡ:橙色; 和DⅢ: 蓝色; E: Sindbis病毒衣壳蛋白c端有序结构域（PDB ID: 1svp）106 264A: Surface-shaded view of Sindbis virus at 9A resolution and viewed down at the icosahedral twofold axis. The flower-like trimeric spikes are seen in blue, and small portions of the lipid bilayer are seen in green; B: A central cross-section of the virus particle showing the organization of the particle with the glycoproteins (blue), skirt region of the envelope (turquoise), the lipid bilayer (green) penetrated by the transmembrane helices of glycoproteins, ordered protease domain of the capsid protein (yellow), disordered protein RNA region (orange) and RNA region (red); C: Radial section at 208 A of the 9 A structure showing the nucleocapsid core viewed down at the icosahedral twofold axis; D: Structure of the Semliki Forest virus envelope protein E1 in the monomeric conformation (protein data bank identification [PDB ID]: 2ala).The domains (DⅠ, DⅡ and DⅢ) are colored according to the scheme DⅠ: red; DⅡ: orange; and DⅢ: blue.(E) Structure of the ordered C-terminal domain of the Sindbis virus capsid protein (PDB ID: 1svp) 106 264

　　2.2、 GETV编码的结构蛋白及其功能

　　2.2.1、 衣壳蛋白（Cap）

　　甲病毒结构蛋白是从亚基因组26S mRNA翻译而来的多聚蛋白。核衣壳蛋白属于N端的多聚蛋白，具有丝氨酸蛋白酶活性，可以通过顺式作用从新生多肽链中释放自身。这种蛋白质被认为是在酶的活性部位与化学键发生折叠并被裂解，因此蛋白质水解非常迅速。当26S mRNA被翻译后，Cap蛋白随即产生。最近的研究表明，一种终止衣壳蛋白C端下游2个残基的结构被正常裂解，从而产生的衣壳蛋白。另外，衣壳蛋白中有一些区域与RNA特异性结合，新合成的衣壳蛋白与大核糖体亚单位结合，这种结合反应可能在衣壳蛋白进入细胞后被激活[14]。

　　2.2.2、 E3蛋白

　　E2糖蛋白存在于包膜中，负责受体的附着。成熟的E2是由病毒成熟后期pE2前体蛋白的呋喃蛋白裂解形成，产生E3和E2。大多数甲病毒在病毒粒子中不保留E3。

　　2.2.3、 E2蛋白

　　E2蛋白是一种长而薄的分子，在穗状花序顶端有一个高度暴露的叶状结构，随后是较窄的茎，茎绕着E1蛋白分子旋转[15]。E2蛋白的前260个氨基酸构成外域，约100个氨基酸形成茎区和30个氨基酸组成的跨膜螺旋。E2蛋白的羧基端结构域由33个与NC核相互作用的氨基酸组成[16,17]。其叶状结构与E1糖蛋白结构域Ⅱ的远端、E2的茎部与E1的Ⅰ、Ⅲ结构域之间存在着接触。受体附着位点位于E2残基附近，与E2残基相关的碳水化合物位于大而突出的叶状表面[18]。

　　2.2.4 、6K蛋白

　　6K是一种小的多肽，尽管相对于其他结构蛋白翻译成等摩尔量的量，但仍以少量（730个拷贝）的形式被整合到病毒粒子中[19,20]。在低温电子显微镜病毒粒子结构中，6K的存在和位置尚未确定。病毒粒子中存在的6K蛋白被认为是甲病毒粒子的必要结构成分[21]。在6K区域引入的几个变化，包括减少6K棕榈酰化的突变[19,22]，或编码该肽的序列的缺失[23]，导致感染性病毒的产量大大降低。然而，分离出来的病毒颗粒完全不含6K，并且在结构上与野生型颗粒难以区分。缺乏6K蛋白的SFV突变体的生长对受感染的宿主细胞有很强的依赖性，哺乳动物细胞在装配过程中受到的影响要比昆虫细胞大得多。在合成后不久，6K蛋白与pE2/E1异质二聚体结合，然后被转运到病毒在质膜组装的位点[19]。由于在pE2蛋白的C端存在一个信号序列，6K蛋白在ER膜上发生共翻译易位，包括一个16-氨基酸腔域和两个跨膜域，两个跨膜域由一个短的（8个氨基酸）细胞质环连接。

　　2.2.5、 E1蛋白

　　甲病毒E1蛋白将病毒表面蛋白转化为细胞膜上的离子渗透孔，负责病毒进入时病毒包膜与宿主内体膜融合[24]。这些孔被认为对Na+、K+和Ca2+离子具有渗透性，并允许核内体质子流入细胞质以交换K+离子。这种生理机制可能导致内泌体附近的低pH区，从而导致病毒基因组的局部核心解体和翻译。E1在内胚体酸化过程中使融合能力增强。酸性环境导致病毒糖蛋白的重新排列，暴露了先前隐藏在E1中的融合肽。将E1融合肽插入宿主内体膜被认为是一个协同的过程，产生由5～6个同源三聚体组成的环[25]。交联研究表明，融合后的三聚体由E1-E1相互作用维持，这一结果与发现一致，即病毒包膜与细胞膜融合后E1-E2异质二聚体解体，产生E2单体和E1同型三聚体[26]。通常隐藏在中性pH下的其他E1区域（融合肽除外）也暴露在融合活性构象中[27]。位于位置3的组氨酸残基在膜融合过程中调节E1的低pH依赖性重折叠[28]。融合环阻断细胞融合（G91D）突变，这是由于膜融合后期的一个阻断，涉及E1同三聚体缺乏有效的形成[29,30]。进入时暴露在低pH值环境中可能不是蚊子细胞感染过程中的一个强制性步骤。

　　3 、甲病毒复制机制

　　目前，对于盖塔病毒研究有限，已知的盖塔病毒可以在节肢动物宿主和脊椎动物宿主中复制，在节肢动物中产生持续终生的感染，而在脊椎动物中导致急性感染，通常是短期感染。这种情况也反映在细胞培养中，甲病毒在蚊子细胞中产生持续感染，在这种情况下，细胞存活并继续在低水平上产生病毒，但在脊椎动物细胞能够产生细胞溶解性感染。由于该病毒不能抑制宿主大分子合成，且产生的病毒产物水平较低，因此在蚊子细胞中持续感染的研究一直较为困难。在感染甲病毒的脊椎动物细胞中，宿主大分子合成受到抑制，病毒产物大量产生，很容易被观察到。甲病毒在蚊子细胞中的复制对达契霉素等抑制剂敏感[14]，在去核细胞中复制能力降低，这表明感染需要一个功能核[31]。在脊椎动物细胞中，即使有达契霉素等抑制剂存在，也可以获得正常复制。虽然没有证据表明在感染过程中需要细胞核，但脊椎动物细胞经长时间的达契霉素等抑制剂处理后产生较低的病毒量，这表明病毒在这些细胞中复制也需要细胞核编码功能。此外，研究发现许多病毒基因组的突变对不同细胞系的病毒复制有不同的影响，这表明病毒与宿主蛋白之间存在相互作用[14]。

　　甲病毒感染脊椎动物细胞的一个标志是能够在不影响病毒蛋白和核酸合成的情况下关闭宿主转录和翻译。这些功能的关闭导致宿主细胞IFN-α/β产生减少，先天免疫系统减弱。这些功能似乎部分地映射到旧世界病毒中的nsP2和新世界病毒中的CP[32]。宿主细胞翻译起始因子eIF2α磷酸化可能介导宿主细胞相关蛋白质合成的关闭，dsRNA病毒的宿主蛋白激酶翻译sRNA，病毒次基因组RNA的翻译不需要宿主eIF2α[33]。随着宿主大分子合成的停止，细胞病变效应的发展也随之发生。脊椎动物细胞感染甲病毒通常会诱导凋亡通路[34]。这一途径已被证明对受感染生物体神经元发病机制的研究具有重要意义[35]。在一些甲病毒中，细胞的凋亡已经被证明是膜融合的过程，该过程通过病毒包膜蛋白的表达完成，或通过nsP2和RNA复制的表达发生[36,37]。目前研究又发现了宿主细胞凋亡能够促进病毒复制但不诱导细胞凋亡的突变体，通过转染具有复制但增殖缺陷的病毒RNA，从而消除病毒粒子进入的过程，也能诱导细胞凋亡。因此，有多种机制被认为参与了甲病毒感染诱导细胞凋亡的过程，可能同时涉及宿主和病毒诱导的细胞凋亡。甲病毒与凋亡的研究在近年来的研究中得到了广泛综述[37,38]。在感染过程中，甲病毒主要利用宿主生物膜结构，其中内溶酶体膜和溶酶体膜被重新排列成液泡结构。这些被称为细胞病变液泡，直径12 μm，被认为是病毒复制复合体[39]。

　　图2 病毒复制模式图[40]  

　　Fig.2 Pattern of GETV replication[40]

　　注: 病毒的生命周期从病毒粒子附着在细胞受体(左上角)开始，然后细胞受体介导的内吞作用、病毒包膜的融合、核心的解体和基因组RNA的释放。然后，复制蛋白被翻译和处理(左下)。这些复制蛋白使输入基因组RNA的复制和亚基因组mRNA的翻译成为结构蛋白(底部中心)。糖蛋白通过内质网转运，经过高尔基体加工并运输到质膜。基因组RNA和衣壳的细胞质组装产生核衣壳核，核衣壳核与质膜上加工过的糖蛋白结合，产生出芽(右上) Note: The lifecycle starts with the attachment of a virion to the cellular receptor (top left), after which receptor-mediated endocytosis, fusion of the viral envelope, disassembly of the core and release of the genomic RNA occur. The replication proteins are then translated and processed (bottom left).These replication proteins enable the replication of the input genomic RNA and translation of the subgenomic mRNA into structural proteins (bottom center). Glycoproteins are translocated across the ER, processed and transported through the Golgi to the plasma membrane. Cytoplasmic assembly of genomic RNA and capsid produces the nucleocapsid core, which associates with processed glycoproteins at the plasma membrane, resulting in budding (top right). Scale varies. ER: Endoplasmic reticulum; nsP: Nonstructural protein; PM: Plasma membrane

　　4、 小结

　　甲病毒在哺乳动物细胞中引起细胞溶解性感染，同时在蚊子细胞中引起非细胞病变的持续性感染。蚊媒对甲病毒的适应是甲病毒流行株传播的主要因素。40多年的甲病毒研究虽然对受感染的哺乳动物细胞进行了广泛的研究，但甲病毒在蚊虫细胞中的复制和组装的形态学和结构学仍然知之甚少。近年来，盖塔病毒已经成为危害畜牧业的一个潜在威胁，国内于2018首次报道了湖南省某猪场爆发盖塔病毒病疫情，经济损失严重，随后在山东某猪厂也出现盖塔病毒疫情，而国内对于盖塔病毒的研究相对较少[41]。同时相关宿主蛋白在病毒生命周期中的作用以及宿主与病毒蛋白作用还有待探究。因此对宿主因子在宿主抗病毒活动的进入、复制、组装和调节方面的功能进行详细解析将会更好地了解宿主与盖塔病毒的相互作用。目前，甲病毒E2蛋白的研究相对成熟，这也加深了我们对病毒粒子结构的理解，而对剩余非结构蛋白结构的阐明可能会对其活性和相互作用产生新的思路。甲病毒作为一种病毒载体在分子生物学和治疗学中的应用也在不断发展。含有荧光蛋白与单个非结构蛋白融合的病毒结构已经产生，这可能有助于进一步探索非结构蛋白和复制复合物的功能和定位。甲病毒已经被证明在哺乳动物系统中表达异种蛋白方面是有用的，而甲病毒复制子将继续为疫苗和基因治疗提供载体。此外，以甲病毒成熟的研究背景为基础，也将有利于阐明盖塔病毒的侵袭机制。

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