摘 要： 管家基因 (HKG) 是一类在不同组织中表达稳定, 且受环境干扰较小的基因的总称。管家基因检测已被广泛应用于物种进化分析, 鉴定以及复杂生物样品的安全监测领域。生物气溶胶成分复杂, 管家基因鉴别不同物种的能力为环境气溶胶成分分析提供了新的手段。本文列举了近年来国内外研究中常用的植物、动物和微生物共15种管家基因, 总结了其在生物物种鉴定的作用, 旨在为环境样本中的复杂生物成分分析提供参考依据。
关键词： 管家基因; 气溶胶; 动物; 植物; 细菌; 真菌;
Abstract： House-keeping genes (HKGs) are a group of genes that express stably in different tissues, and are less disturbed by external conditions. These genes are widely used in species evolution analysis, identification and safety surveilance of complex biological samples. This review list 15 species of HKGs of plants, animals and microorganisms which commonly used in domestic and international research in recent years, summarized their role in the identification of biological species. It is hope for providing a reference for the follow-up study and application of HKGs in analysis of environmental bioaerosol samples.
Keyword： Housekeeping genes; Aerosol; Animal; Plant; Bacteria; Fungi;
管家基因指在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因, 其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响, 因此管家基因常常作为研究基因表达的内参对照[1]。管家基因在掺杂鉴定、食品溯源等领域有十分重要的作用, 现行的许多行业标准都将管家基因作为鉴别物种的分子标记[2]。食品、饲料、微生物制剂、血液制品、生物制品甚至空气生物气溶胶样品等均属于潜在来源复杂的混合样本, 其中的生物学成分复杂, 可能包含病毒、细菌、真菌、植物、动物、人类等来源的成分, 有效鉴别这些组分, 可为环境生物危害评估提供依据。因此, 管家基因也有潜力作为区分生物气溶胶样本中不同生物成分的标志, 特别是细菌、真菌、动植物等成分等都有着各自明确而独特的管家基因种类, 检测这些基因, 理论上可以识别这些成分的生物来源。
本文选取在动物、植物、微生物中广泛使用的15种管家基因, 对其基因的种属特性、序列特点, 以及其在食品安全、物种鉴别、病原体溯源等领域的相关检测应用进行综述, 为复杂生物样本的种属基因成分分析或物种溯源等研究提供参考依据。
1、 动物管家基因
随着20世纪90年代早期现代测序技术的兴起, 分子生物学的发展迅速。在动物物种的分类鉴定中, 传统形态学鉴定方法受到物种形态完整度、性别和发育阶段等限制, 大大制约了物种的快速精准鉴定。分子生物学鉴定因具操作简单方便、检测快速和准确度高等优势被广泛应用于生物物种鉴别[3,4,5,6]。利用管家基因保守的分子特征将其DNA序列作为分子标记应用到物种的鉴定、分类及特征描述中十分必要[7]。动物物种鉴定中常见的管家基因有线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基I (cytochrome oxidase subunit I, COI) 、同源异形盒基因 (homeobox, Hox) 和核糖体RNA等。
1.1、 COI基因
细胞色素氧化酶是参与线粒体电子传递链末端氧化步骤的重要呼吸酶, 由3个亚单位组成, 其中编码亚单位I的COI基因具有序列保守、通用引物覆盖面广等优势, 在动物物种的鉴定中被广泛应用。COI基因可以用于蜘蛛的分类鉴定, 对49科313属的816种蜘蛛的种属和家系鉴定准确率分别高达95%和91%[8]。对11个门13 320个物种的COI基因序列进行比较分析, 发现除了刺胞动物门外, 98%的物种属间COI基因的平均差异程度为11.3%, 同种间平均差异程度在2%之内[9], 表明COI基因可以作为研究种属间亲缘关系和物种种内鉴定的靶序列。潘艳仪等以COI为基础设计通用引物, 可以准确高效地鉴定鲶鱼、草鱼、黄牛和家猪等多种动物源性的复杂组分[10]。
1.2、 Hox基因
Hox基因是真核生物体内长度约180 bp的高度保守DNA序列, 也是同源异形盒家族的一员[11]。Hox基因通常成簇分布, 哺乳动物的39个Hox基因成员被分为13个平行组 (paralogous groups, PGs) , 紧密聚集在HoxA、B、C和D共4个位点上[12]。昆虫的Hox基因与动物的腹足发育相关, 是研究昆虫腹肢起源进化的重要基因[13]。Hox基因在动物胚胎发育中对于器官的形成具有重要的调控作用, 例如人类的HoxA、HoxB、HoxC和HoxD分别调控人类四肢的发育[14]。有学者利用HoxC5基因片段检测植物油和地沟油样品, 发现植物油鉴定结果均为阴性, 而地沟油样品鉴定结果均为阳性, 证明HoxC5基因具有区分动植物物种的能力[15]。
1.3、 核糖体RNA
核糖体由核糖体RNA (ribosomal RNA) 和多种蛋白质组成。真核生物的核糖体r RNA由28S、5.8S、5S和18S组成, 原核生物有5S、16S及23S。16S rRNA和18SrRNA已成为研究物种进化关系和种属分型的常用分子标记, 我国现行的动物源性食品检测中有许多将16S rRNA和18S rRNA列为检测的内参基因或特异性检测引物的国家标准, 如GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》中将18S rRNA作为内参照引物检测动物成分[16], DB12/T653—2016《鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR法》也选用了16S rRNA作为内参引物。鱼虾类或两栖类动物的进化研究更倾向于使用线粒体12S rRNA作为目标基因, 12S rRNA也同样被应用于动物源性商品的鉴别检测[17]。
动物管家基因种类繁多, 除甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 和肌动蛋白β (beta-actin, ACT-β) 应用最为广泛以外, 其余管家基因如磷酸甘油酸激酶 (phosphoglycerate kinase, PGK) 、果糖二磷酸醛缩酶A (fructose dialdecyl esterase A, ALDOA) 和乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase, LDHA) 基因等在肿瘤诊断治疗、细胞通路和细胞代谢等研究领域也有重要应用[18]。
2、 植物管家基因
植物物种分布广泛, 数量庞大。目前用于植物种属分类的管家基因通常由两个或多个基因互补组成, 应用广泛的主要包括:rbcL+matK, trnH-psbA, ITS和trnL[19]。
2.1 、rbcL+matK基因
matK基因位于叶绿体赖氨酸trnK基因的内含子中[20], 是叶绿体基因组中进化速率最快的基因之一, 也是最早被应用于植物发育研究的序列。对加拿大维管束植物的3个管家基因matK、ITS2和rbcL的匹配度分析发现, matK的同源性最高 (约81%) [21]。但matK基因在被子植物中则差异较大[22]。
rbcL是叶绿体基因组中编码二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的基因, 广泛应用于植物的系统进化和分类鉴定, 也可用于药物成分的鉴定, 区分原料药是否真实[23]。对105科的151个不同属植物基因组比对发现, rbcL的覆盖度约为43%, 但很难识别衫科植物物种。因此, 常常应用rbcL+matK的双位点组合。rbcL+matK的双位点组合对550种陆地植物的物种鉴定正确率可以达到72%[24], 将核桃、花生、芝麻、大豆和榛子样本DNA混合, 引物rbcL-4可检测到其中的花生DNA, matK-4可检测到大豆DNA, 说明rbcL+matK组合可用于鉴定核桃饮料中的掺杂组分[25]。
2.2、 matK+ITS基因
除了叶绿体基因, 核糖体内部转录间隔区 (internal transcribed spacer, ITS) 也常常用做植物DNA条码序列[26]。将ITS、rbcL、matK基因两两组合用于猪笼草科猪笼草属的DNA条形码的评估, ITS+matK的组合因具有独特的条形码间隙而表现出最佳的物种区分, 是猪笼草属的核心条形码[27]。ITS+matK组合在41种榄仁属222株植物的管家基因中覆盖率高达94.44%[28]。
对植物的4个管家基因matK、rbcL、trnH-psbA和ITS进行比较, 计算4个单条形码及其组合的遗传距离, 发现ITS+matK在大多数情况下的表现优于4个单个条形码, 因此ITS+matK可作为大型植物属的核心条形码[29]。
2.3、 trnH-psbA基因
trnH-psbA序列表示trnH和psbA两个基因的间隔区, 是叶绿体基因组中进化最快的间隔区之一, 其两端有75 bp的保守序列, 便于引物设计。trnH-psbA有着较强的种属鉴别能力, 对13 727种子囊植物、3 054种单子叶植物、633种裸子植物、277种苔藓和292种蕨类植物的鉴别成功率分别为64.5%、54.7%、37.0%、78.3%和75.3%[30]。在食品安全监测方面, trnH-psbA作为DNA条形码已经应用于意大利北部阿尔卑斯山区的4种多花蜂蜜的鉴定[31]。
2.4、 tRNA-leu基因
叶绿体的trnL (UAA) 结构域有保守的二级结构以及交替出现的保守区域和可变区域。因此, trnL序列具有引物高度保守、扩增系统稳健的优势, 可广泛应用于食品工业、法医学及基于粪便的饮食分析等[32]。一些文献常将其称为t RNA-leu。将t RNA-leu基因作为内参基因, 可检测粉丝中绿豆、豌豆、玉米、红薯、土豆等植物成分的存在[33], 还能有效检测出鱼糜样本中的植物成分[34]。
上述基因大部分是叶绿体基因组中序列较为保守的基因, 在制备植物特异性DNA条形码时有着得天独厚的优势。但对于某些植物, 如非洲的使君子科, rbcL+matK+trnH-psbA组合才能更好地发挥作用[35]。因此对亲缘关系相近或者特点鲜明的植物进行分型鉴别时, 要更有针对性地选择管家基因, 提高物种鉴别的准确性。另外, rpoC1、atpF-atpH也是常用的植物DNA条形码[36]。
3、 细菌管家基因
细菌的管家基因主要有核糖体RNA、DNA促旋酶A (gyrase A, gyr A) 和DNA促旋酶B (gyrase B, gyr B) 、重组酶A (recombinase A, recA) 、胞膜蛋白A (secretory A, secA) 等, 在细菌DNA复制、损伤修复过程中起关键作用, 因此是细菌基因表达研究中常用的内参基因[37]。
16S rRNA基因在所有细菌中稳定表达, 是细菌系统分类中最常用的分子钟[38]。细菌核糖体16S rRNA基因序列全长约1 550 bp, 由交替的保守区和可变区组成, 利用该基因保守区域设计引物, 几乎能与细菌所有种属的核糖体靶位点结合, 被当做细菌分型鉴定的通用型引物[39,40]。
用16S rRNA基因测序的方法可以检查结节病患者淋巴结活检样本中的细菌谱, 验证痤疮丙酸杆菌与结节病之间的关系[41];16S rRNA基因在慢性非细菌性前列腺炎患者中比在正常成人中更容易被检测到, 因此推测一些不可培养的细菌可能是慢性非细菌性前列腺炎的病因[42]。基于16S rRNA基因序列的同一性为细菌和古细菌的高分类群提出了合理的分类学界限, 近乎完整的16S rRNA能准确测量细菌分类多样性[43]。
gyr A和gyr B基因在细菌中稳定表达。gyr A和gyr B的突变可能导致细菌耐抗生素能力的缺失, 现多用于结核杆菌等致病菌的抗药性研究[44]。gyr A和gyr B的表达稳定性仅次于16S rRNA, 因此还可用于细菌分型鉴定[37]。
4、 真菌管家基因
核糖体RNA基因及其ITS是目前最常用的真菌管家基因, 广泛应用于真菌分类鉴定, 真菌耐药性分析、基因溯源等方面的研究[45]。
同细菌相比, 在大多数真菌生态学研究中, 真菌物种的鉴定依然不够准确, ITS序列常常作为真菌的通用条形码鉴定不同种类真菌[46]。应用ITS序列可以对水生丝孢菌进行物种鉴定和分型[47], 还可对冷冻保存的真菌分离物进化系统进化分析[48]。为了快速准确地鉴定致病性真菌, 辅助早期诊断和靶向治疗, 以悉尼医院为代表的多家研究机构建立了一个ITS数据库, 包含2 800个ITS序列, 代表421个真菌物种, 为医学界提供了一个免费的真菌检索工具[49]。
核糖体大亚基26S-LSU序列的D1/D2结构域也常常和ITS一起用来区分真菌, 通过对7 300个丝状真菌的24 000序列进行人工验证, 发现ITS和LSU可将大部分真菌分类到种水平[50]。以酵母的26S rRNA和霉菌的28S rRNA作为目标基因的荧光PCR, 可对食品中常见的霉菌和酵母菌进行检测[51], 用于食品中微生物的检测。
5、 展望
管家基因在食品成分检测、物种鉴定和产品溯源分析等方面起着举足轻重的作用, 伴随分子生物学技术的不断完善以及生物信息学的快速发展, 对管家基因的研究已逐渐成为潮流, 特别展现了其在复杂生物成分归类分析和鉴定方面应用的潜在优势。
近年来, 生物安全愈发受到重视, 生物气溶胶作为评价空气质量的新指标走入公众的视野。然而目前对于空气中微生物成分的监测手段相对缺乏, 因此, 将管家基因应用到气溶胶样本监测中具有十分重要的意义[52]。中国检验检疫科学研究院利用管家基因研发试剂盒, 开展了较长时间和跨地域的空气样本监测, 初步证明环境生物气溶胶采集富集后的液相小样本可以检出动物、植物、微生物的管家基因, 提示利用管家基因检测评价空气中复杂生物物质属性的可行性, 相关研究论文正在整理中。
随着各种管家基因研究的深入, 在现有高通量测序和快速检测基础上, 结合痕量生物样本采集富集技术, 通过广谱覆盖的、不同特异性种属管家基因检测分析, 将促进各种复杂生物样品的基因分析、分类、鉴定和溯源的深入研究, 可能成为复杂样本分析研究热点之一。
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