摘要：甲状腺癌是内分泌科中最常见的恶性肿瘤, 而甲状腺乳头状癌 (PTC) 是甲状腺癌最常见的病理类型。目前PTC在临床上缺乏早期实验室检验指标, 但伴随着实验室检测技术不断进步, PTC分子生物学标志物的研究在近年来取得了较大进展, 其中包括微RNA、生化标志物以及基因标志物, 这些标志物在PTC中均有异常表达, 且与肿瘤的发生、发展密切相关, PTC分子生物学标志物有望成为诊断PTC的新标准。深入研究PTC分子生物学标志物可为临床医师提供肿瘤发病情况的实时信息, 发现早期肿瘤提供有力的证据。
关键词：甲状腺乳头状癌; 分子生物学标志物; 微RNA; 癌基因;
Research Progress of Molecular Biomarkers for Papillary Thyroid Cancer
WEI Hongfa NING Jie FENG Xiaoling
Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital
Abstract：
Thyroid cancer is the most common malignant tumor in endocrinology, and papillary thyroid carcinoma ( PTC) is the most common pathological type. At present, PTC is lack of early laboratory test index. However, with the continuous improvement of laboratory detection technology, the study on molecular biomarkers of PTC had made great progress in recent years, including miRNA, biochemical markers and genetic markers. These markers had abnormal expression in PTC, and were closely related with the occurrence and development of tumors. Molecular biomarkers of PTC are expected to be a new standard for the diagnosis of PTC. The study on molecular biomarkers of PTC provides clinicians with real-time information on the incidence of tumors and provides more powerful evidence for the detection of early tumors.
Keyword：
Papillary thyroid carcinoma; Molecular biomarkers; MicroRNA; Oncogene;
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一, 而伴随着近年来分子生物诊断技术的不断发展进步, 甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势[1]。2008年国际癌症研究机构五大洲癌症发病率报告结果发现, 全球甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势, 且甲状腺癌发病率约为3.1/10万, 而中国甲状腺癌发病率为1.4/10万[2]。而甲状腺乳头状癌 (papillary thyroid cancer, PTC) 是甲状腺癌最常见的病理类型, 预后好, 但易发生早期淋巴结转移及术后复发[3,4]。目前PTC在临床上主要靠甲状腺穿刺病理活检明确诊断, 缺乏早期实验室生化指标, 对其早期淋巴结转移的预防、及时治疗和预后的判断造成一定困难。因此, 进一步探讨PTC的特异性肿瘤标志物, 应用于PTC的早期诊断、治疗和预后成为近年来研究的热点之一。近年来关于PTC的分子生物学标志物的研究取得了较大进展。现就PTC相关微RNA (microRNA, miRNA) 、生化标志物、相关基因在PTC诊断中的研究现状进行综述。
1 PTC中miRNA标志物
miRNA是真核生物中一类进化上高度保守的非编码单链小分子RNA, 定位于独立编码的RNA或蛋白编码基因内显子[5]。miRNA以多种形式存在, 长度为300~1 000个碱基的初始转录产物 (primicroRNA, pri-miRNA) 是最原始的;pri-miRNA经过一次加工后, 成为长度为70~90个碱基的miRNA前体 (pre-microRNA, pre-miRNA) ;经过Dicer酶, 即核糖核酸内切酶, 属于RNAⅢ家族中特异识别双链RNA的一员, 酶切后pre-miRNA再成为长20~24 nt的成熟miRNA, 然后被整合进miRNA沉默复合物中, 进一步负性调控制特定的信使RNA (messenger RNA, mRNA) 转录后表达[6]。目前研究发现2 578种miRNA, 其中人体30%以上的mRNA参与细胞凋亡、增殖, 一种miRNA可能参与200种以上mRNA调控, miRNA的表达异常参与恶性肿瘤的形成, 而且参与肿瘤的浸润和转移[7]。
1.1 miRNA在PTC中的表达情况
Peng等[8]通过定量实时聚合酶链反应 (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR) 、基因芯片技术分别检测PTC和结节性甲状腺肿组织中相关miRNA的表达情况, 发现在PTC和结节性甲状腺肿组织中, miR-30a-3p、miR-199b-5p、miR-146b-5p的表达存在显著差异, miR-30a-3p表达下调, miR-199b-5p、miR-146b-5p表达上调, 而且靶基因分析提示上述miRNA在PTC的发生发展过程中的某些信号通路转导中发挥一定的作用。Sun等[9]通过检测63例PTC患者 (其中男25例, 女38例) 中甲状腺组织及邻近非癌正常组织中的miR-144表达情况, 发现miR-144在PTC甲状腺组织中的表达明显低于邻近正常组织, 且与肿瘤的大小密切相关 (P<0.001) , 受试者工作特征曲线也提示miR-144有望成为PTC的潜在生物标志物。Li等[10]研究发现, 通过检测甲状腺癌标本、邻近甲状腺正常组织以及正常甲状腺细胞系的miR-212的基因表达水平, miR-212表达在甲状腺癌标本和细胞系中明显下降, 且甲状腺癌组织中miR-212的下调与淋巴结转移和晚期临床表现呈负相关。Liu等[11]通过检测126例PTC中miRNA的表达情况, 发现124种miRNA存在表达异常 (P<0.01) 。Dettmer等[5]在PTC中也发现miRNA表达差异, 其中miR-221、miR-182、miR-183、miR-222表达上调, 而miR-574-3p、miR-455、miR-542-5p及miR-199a表达下调。相关研究也发现在正常甲状腺组织和PTC甲状腺组织中, miR-146b的表达也存在显著差异[12,13]。
1.2 与PTC侵袭性行为的相关的miRNA标志物
随着对miRNA研究的深入, miRNA不仅在PTC中存在表达失调, 还对评估PTC的肿瘤侵袭性具有重要意义。Lu等[14]研究发现, 通过检测浸润性PTC和非浸润性PTC中miRNA的甲状腺基因表达水平, 在浸润性PTC和非浸润性PTC中, miR-222、miR-34b、miR-146b及miR-130b的表达均存在显著性差异, 而且miR-146b和BRAF (v-raf murine surcoina viral onvogene homolos B1) 基因突变阳性的浸润性PTC与BRAF基因突变阴性的浸润性PTC患者相比, BRAF基因突变阳性的浸润性PTC患者差异性更明显。Chou等[15]发现在PTC中miR-146b、miR-222及miR-221的表达上调与肿瘤的侵袭性密切相关, 而miR-1、miR-191和miR-486在PTC中表达下调, 与肿瘤的预后及远处转移密切相关。Yang等[16]通过检测浸润性PTC和非浸润性PTC的甲状腺组织中miRNA表达, 发现在浸润性PTC中除miR-16和miR-613下调外, 还有miR-221、miR-222和miR-146b-5p的差异上调, 提示miR-221、miR-222和miR-146b-5p表达上调与甲状腺癌细胞浸润和转移存在密切的相关性, 且miR-613和miR-16可能对PTC的肿瘤侵袭起到一定的抑制作用。Wang等[17]发现miR-146b、miR-221、miR-222及miR-135b与PTC的包膜侵犯有关, 其中miR-146b的表达水平亦与包膜的侵犯程度具有相关性。
1.3 与PTC预后相关的miRNA标志物
目前研究发现对于判断PTC的发展及预后方面, miRNA起到一定的关键作用, 为临床医师更准确有效的诊疗PTC提供潜在的基因标志物。Lee等[18]通过检测复发组PTC患者以及非复发组PTC患者中的miRNA基因表达水平, 发现非复发组PTC患者miR-222及miR-146b的表达明显低于复发组PTC患者, 提示miR-222及miR-146b的表达水平对判断PTC的复发及预后有一定作用。Chou等[19]研究发现, 在PTC患者中, 总体生存率较低的患者miR-146b表达水平显著高于总体生存率较高的患者, 且miR-146b的过度表达可显著增加肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力, 并对化疗药物产生耐药性, miR-146b与肿瘤的预后密切相关。Acibucu等[20]也通过检测发生远处转移的PTC患者中miRNA的相关基因表达水平发现, 与未发生远处转移的PTC患者相比, 发生远处转移的PTC患者miR-146b和miR-221表达水平显著升高, 提示miR-146b和miR-221与PTC的远处转移密切相关。
2 PTC生化标志物
2.1 细胞角蛋白19 (cytokeratin-19, CK19)
CK19是一个低分子量的中微丝角蛋白。CK19广泛存在于单层上皮和间皮来源的肿瘤细胞中。低分子量的角蛋白与高分子量角蛋白同样具有鉴别不同程度分化的甲状腺上皮的作用。Handra-Luca等[21]通过显微镜下用免疫组织化学法检测PTC癌细胞的CK19表达发现CK19的细胞质弥漫性表达是PTC的重要诊断因素, 且在PTC细胞中存在与CK19相关的细胞核仁通道。Cheung等[22]研究发现, CK19广泛染色是诊断PTC的有利证据, 而CK19的局部染色多见于良性甲状腺疾病, 且发现抗间皮细胞抗体1 (anti mesothelial cell antibody-1, HMBE-1) 染色阳性也提示PTC的存在, 联合CK19的检测用于诊断PTC更准确, 而CK19虽然特异性不佳, 但CK19阴性可以协助排除PTC诊断。Giovanella等[23]也发现CK19在PTC组织中高表达。Liu等[24]通过免疫组织化学染色分别测定257例PTC和149例良性甲状腺组织的CK19表达水平, 发现PTC组中CK19的表达水平明显高于良性甲状腺组织组。
2.2 半乳凝素3 (galectin-3)
galectin-3是galectin家族的一员, 在各种动物体内均有广泛分布, 对β半乳糖苷存在一定的亲和力, 对于细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应以及肿瘤转移的发生发展过程起关键作用, 由N端和C端糖类识别区组成的多肽能特异性地识别并结合β半乳糖苷[25]。目前国外研究发现galectin-3参与调控肿瘤分化、侵袭及血管新生等肿瘤发生和发展的多个环节[26,27]。galectin-3经常被用于甲状腺细针穿刺术前或术后病理检查中对于甲状腺结节的良恶性诊断[28]。Tang等[29]通过分析发现, galectin-3可能成为鉴别PTC和非PTC的潜在标志物, 而且在PTC患者中galectin-3的阳性表达与肿瘤淋巴结的远处转移密切相关。Mataraci等[30]研究发现, galectin-3在甲状腺恶性肿瘤中的表达显著升高, 特别是PTC, 与良性甲状腺结节相比, PTC中galectin-3的表达显著升高。Papale等[31]通过甲状腺细针穿刺术检测galectin-3的表达水平, 发现galectin-3与甲状腺癌的细胞增殖、病理相关。Salajegheh等[32]研究也发现, 在合并淋巴结转移的PTC患者中galectin-3的表达也显著增加。
2.3 HMBE-1
HMBE-1是间皮细胞微绒毛表面的特异性标志物, 为单克隆抗体, 主要成分为透明质酸, 在肿瘤血管的形成、生长及转移等方面起重要作用[33,34]。Arcolia等[35]通过免疫组织化学法分别检测66例PTC和66例甲状腺腺瘤中HMBE-1、甲状腺过氧化酶抗体、galectin-3和CK19等的表达水平, 发现在PTC中HMBE-1、galectin-3和CK19的表达水平显著高于甲状腺腺瘤组, 而且HMBE-1联合CK19的表达水平对诊断PTC具有更大的诊断价值。Zhou等[36]也同样通过免疫组织化学法检测80例PTC和40例良性甲状腺结节患者中HMBE-1、galectin-3和CK19等的表达水平, 发现CK19、galectin-3和HBME-1在PTC中的阳性表达率为99%、95%和71%, 在鉴别诊断中的灵敏度分别为99%、95%和71%, 特异度分别为63%、75%和85%, 诊断准确度为87%、88%和76%, 表明对CK19、galectin-3和HBME-1蛋白的检测可能有助于PTC的鉴别诊断。Liu等[26]研究发现HBME-1单独诊断PTC的灵敏度为85.3%, 联合CK19、galectin-3检测可进一步提高对于PTC的诊断价值。Wu等[37]研究也发现HBME-1的表达增加有利于PTC的鉴别诊断。
3 PTC基因标志物
近年来随着分子生物学诊断技术的不断发展, 对于致癌基因与癌症发生的深入研究, 甲状腺癌的相关基因逐渐成为其诊断过程中重要的标志物, 激酶受体及生长因子属于致癌基因的关键产物, 在正常细胞向癌细胞的转变过程中癌基因发挥了非常关键的作用。目前研究较多的与甲状腺癌发生、发展或预后密切相关的基因有RET (rearranged during transfection) 、BRAF、RAS (radar adsorb support) 和p53。
3.1 BRAF基因
BRAF基因是RAF癌基因激酶家族成员之一, 基因位于7q23染色体, 编码分子量为95 000的蛋白, 属于色氨酸/丝氨酸激酶家族, 多种肿瘤均存在BRAF基因突变, BRAF基因突变后会导致蛋白质产物中第600位的赖氨酸被谷氨酸替代, 最终表达出产物活化蛋白质激酶, 即BRAF V600E, 该突变体可模拟活化区域的磷酸化过程, 参与细胞的异常增殖和分化, 最终导致肿瘤的形成[38]。Geng等[39]研究了48例年龄3~13岁的PTC患儿的BRAF V600E突变的发生率和意义, 发现在48例患儿中有35.4%存在BRAF V600E基因突变, BRAF V600E基因的突变与PTC的肿瘤大小、侵袭性、年龄、转移等密切相关, 且BRAF V600E的存在可能与儿童PTC的部分侵袭性临床病理特征呈负相关。美国甲状腺协会2015年公布的甲状腺结节术前分子诊断共识提示, BRAF V600E突变对于PTC的诊断、预后及治疗方案的选择有重要的指导性作用[40]。Kowalik等[41]分别用测序法、等位基因特异性扩增PCR和定量聚合酶链反应 (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 法检测399例PTC患者的BRAF基因突变, 发现3种方法检测的BRAF基因突变率分别为37%、57%和60%。Suh等[42]研究发现, BRAF V600E的基因突变有助于PTC的诊断分类。Li等[43]的荟萃分析结果显示, BRAF V600E突变与PTC的侵袭性临床病理学特征相关, 有望成为判断其预后的分子标志物之一。Kim等[44]研究发现, 在172例经过甲状腺手术的PTC患者中, 有130例存在BRAF V600E突变, 阳性率为75.6%。
3.2 RET基因
RET基因属于一种原癌基因, 定位于10号常染色体的长臂, 全长约60 kb, 包括21个外显子, 编码大约1 100个氨基酸的酪氨酸激酶受体超家族RET蛋白, RET基因为钙黏素超家族成员的一员, 编码受体酪氨酸激酶的表达, 是细胞表面分子转换并用于细胞生长以及分化的信号, 使体内以及体外均产生致癌性的激活, RET基因通过信号转导通路调节肠道神经系统祖细胞的增殖、分化和迁移[45]。RET基因重排, 特别是RET/PTC基因重排, 在甲状腺癌发生发展中起关键作用。张星等[46]用qPCR检测114例PTC患者组织及癌旁正常组织中RET/PTC的表达, 发现在所有的癌旁正常甲状腺组织中均未发现RET/PTC重排, 而在PTC甲状腺癌组织中有23.68% (27/114) 检测RET/PTC重排, 且RET/PTC阳性PTC患者肿瘤多灶性的发生风险显著增加 (OR=5.57, 95%CI 1.39~22.33) , 同时发现RET/PTC重排与术后1个月促甲状腺素水平异常升高有关 (P=0.037) 。Jargin[47]研究也发现RET/PTC重排有望成为PTC进展的潜在生物标志物。Lee等[48]通过DNA直接测序检测240例经手术切除甲状腺组织且肿瘤分期为3或4期的PTC患者的相关基因变化, 发现在240例PTC患者中, 207例 (86.3%) 至少有一种基因改变, 包括190例 (79.2%) BRAF突变, 25例 (10.4%) 磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α基因突变, 24例 (10.0%) RET基因融合, 且RET基因融合在肿瘤N1b期或年龄45岁以上的PTC患者中出现频率显著增高。
3.3 RAS基因
RAS基因家族中与人类肿瘤相关的基因分别为HRAS、KRAS和NRAS, 最常见的是NRAS。RAS基因中含有4个编码的外显子和1个5'端非编码外显子, 外显子所编码的蛋白为188~189个氨基酸残基, 具有高度特异性和同源性, 并且在氨基酸序列的前80个氨基酸残基中均具有高度保守性, 在人类肿瘤的发生发展中有重要作用[49]。但RAS对于甲状腺肿瘤的诊断价值仍存在争议[50]。Kakarmath等[51]通过检测101例高分化型甲状腺癌患者中RAS的基因表达, 发现RAS基因的阳性表达率为28%。Mehrzad等[52]研究发现, RAS基因突变与PTC肿瘤的侵袭性行为密切相关。Patel等[53]通过检测93例甲状腺结节患者的RAS基因, 其中86例经手术切除了甲状腺组织, 发现在所有RAS阳性的结节中有76%是恶性的, 其中PTC占83%。
4 小结
目前关于PTC的分子标志物研究取得了一定进展, 研究PTC的分子生物学标志物能更加深入地了解PTC的发生、发展的分子生物学机制。PTC分子生物学癌标志物不仅是PTC的诊断工具, 还是判断肿瘤复发、预后的重要工具。联合测定多种PTC肿瘤标志物可为PTC的早期诊断、远处转移的预防及治疗方案的选择提供综合鉴定, 对每例患者的病情做到最为精准的评估, 为临床医师提供准确的病情评估, 制订精确的治疗方案。通过对PTC分子生物学标志物的研究, 结合多种PTC分子标志物的检测, 可以对PTC进行分子水平的分期、分级, 极大地推动肿瘤精准的个性化治疗。
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