山茱萸为左归丸方中主要药味,其主要成分为马钱苷、莫诺苷、熊果酸和齐墩果酸等.在山茱萸的质量研究中,马钱苷研究的已较多;而莫诺苷与马钱苷有相近药效作用,并且含量更高于马钱苷,关于莫诺苷含量测定的研究却很少,是目前山茱萸相关药物质量控制中的一大缺憾.为了更有效控制左归丸的质量,本文采用高效液相色谱法同时测定左归丸中马钱苷和莫诺苷的含量,为更好地评价药物提供科学依据.
1 仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪;KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BP-211D分析电子天平(德国Sartorius公司).左归丸(河南宛西制药股份有限公司,共三批为A、B、C).马钱苷 (批号:111640-200401,供 含 量 测 定用),购自中国药品生物制品检定所.莫诺苷自制,归一化法测定含量>98.0%.其余试剂均为市售分析纯或色谱纯,水为纯净水.
2 左归丸中马钱苷和莫诺苷的含量测定
2.1色谱条件:安捷伦TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:甲醇-水(28∶72),检测波长240nm,柱温40℃,流速1.0mL/min.理论板数按马钱苷峰计应不低于2 000.色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×200mm,5μm),以甲醇-水(28∶72)为流动相,检测波长240nm,柱温40℃,流速1.0mL/min.理论板数按马钱苷峰计应不低于2 000.
2.21照品各10.0mg,分别置20mL量瓶中,加甲醇溶解,并加至刻度,摇匀,分别作为莫诺苷对照品储备液和马钱苷对照品储备液;再分别精密量取适量上述储备液置同一量瓶中,加流动相稀释至每mL含0.05mg的莫诺苷溶液和每mL含0.05mg的马钱苷溶液,作为对照品溶液.
2.3供试品溶液的制备方法:取左归丸研细,取约1g,精密称定,置25mL量瓶中,加甲醇20mL,密塞,超声处理20min(功率150W,频率50kHz),冷却,稀释并定容至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液,用0.45μm滤膜滤过,取续滤液即得.
2.4阴性对照试验:按处方比例取除去山茱萸的其他药材适量,依照左归丸制备工艺和供试品溶液的制备方法得到缺山茱萸的空白对照溶液,作为阴性对照溶液.按照上述色谱条件进行测定,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照色谱上在此保留时间无干扰.
2.5莫诺苷、马钱苷定量范围和线性关系:取莫诺苷、马钱苷对照品储备液,分别精密吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL置10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀.照含量测定项下色谱条件,取上述对照品溶液各20μL,以进样量X(μg)作为横坐标,测得对照品峰面积Y作为纵坐标,进行线性回归测得结果见表1,2.可见,莫诺苷在0.191 6~0.958 2μg进样量范围内,峰面积与进样量呈良好的相关性.马钱苷在0.192 7~0.963 4μg进样量范围内,峰面积与进样量呈良好的相关性.在线性范围内的进样量时可以定量测定.
2.6待测溶液的稳定性:取含量测定项下的样品溶液于0,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,6.0h时分别进样20μL进行测定,结果表明样品在6h内稳定.数据见表3.
2.7进样精密度:取含量测定项下的样品溶液,连续进样6次,记录色谱峰面积,计算进样精密度.结果见表4.
2.8回收率试验:精密称取已知含量的样品(批号A)约0.5g,置25mL量瓶,再分别精密加入莫诺苷对照品储备液0.64mL、马钱苷对照品储备液0.46mL置同一25mL量瓶中,按供试品溶液制备方法平行制得6份供试品溶液,依法测定.结果见表5.
2.9重复性试验:取同一批样品(A),共制备6份,照含量测定项下操作,测定每份样品含量,计算精密度.结果见表6.2.10样品测定:取左归丸3批样品,照含量测定项下方法,测定其中莫诺苷和马钱苷含量,结果见表7.
3 讨论
在中国药典2010版中,山茱萸药材以及含山茱萸的成药中,仅仅测定了马钱苷成分.而莫诺苷作为具有相同药理活性的成分,在山茱萸中含量更高,作为评价指标更为科学.本研究对含山茱萸的药物左归丸同时进行了马钱苷和莫诺苷的测定,质量评价指标更为科学.
