同化激素(ASs)是由动植物产生或人工合成的一类促进细胞生长与分化、扩增肌肉的微量化学物质。同化激素主要分为甾体和1,2-二苯乙烯两大类,包括雌雄激素、孕激素和糖皮质激素,其在畜牧养殖业和近海海产品养殖中大量使用以提高经济效益,造成了动物体内不同程度的激素残留,导致人体机体代谢紊乱、发育异常或潜在致畸致癌风险[1]。
目前很多国家或组织已经立法限制或禁止在食用性动物饲养中使用同化激素。精确先进的激素测定方法是实现激素残留有效监督的重要手段。动物源食品中激素的测定方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[2-4]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[5-7]等。
GC-MS需要衍生化,耗时耗力;高效液相色谱法(HPLC)主要因基质影响大已不常用;高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)集高效分离和多组分定性、定量于一体,灵敏度高,已成为测定各种复杂基质中多种同化激素残留的主要方法。同化激素与其它兽药不同之处在于其具有很强的脂溶性,这使得样品的净化极为关键,因此有效的净化手段是实现激素准确灵敏分析的重要前提。
近年来关于不同基质中激素残留测定的研究越来越多,而目前国内外有关动物源食品中激素残留测定的综述并不多见[8-10],国内现有的综述亦针对性不强[11-13]
,仅列举了激素测定的各种方法,没有针对高效液相色谱-串联质谱法作深入详细的论述,因此有必要对近些年国内外相关的研究做适当总结,以有助于研究者更好地了解激素残留测定的最新方法和研究动态。本文重点综述了动物源食品中同化激素的前处理方法和液相色谱-质谱检测技术,以期为研究者提供参考。
1 样品的提取与净化
1.1结合态分析物的水解
动物源食品中同化激素以游离态和结合态两种形式存在,要检测结合态或激素总量时需首先对样品进行水解以释放激素。常用的水解方法有酶水解和碱水解。碱水解通常使用氢氧化钠溶液;酶水解一般是在样品中加入一定体积的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液或枯草杆菌蛋白酶,然后置于温水浴中水解16h左右。目前酶解这一步存在争议,已有研究表明,动物肌肉中结合态的同化激素比例很低[14],Hartmann等[15]比较肉类样品酶水解效率时发现孵育对激素的提取量无影响;Yang等[6]发现肌肉、虾和牛奶中的内源性激素在无酶解和酶解条件下结果几乎无差异,因此很多研究省略了酶解步骤。
1.2提取
激素类药物极性较弱,常用的提取溶剂有甲醇、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈等。国家标准GB/T21981-2008中[16]以甲醇为提取溶剂,但甲醇提取液的杂质较多,不易净化。孙汉文等[17]比较了乙腈、甲醇和叔丁基甲醚等不同溶剂对牛肉中9种类固醇激素的提取效果,结果发现:若用甲醇萃取,较多的脂肪萃取物易导致堵塞固相萃取柱;叔丁基甲醚提取效果最好。
Seo等[3]以甲醇-水为提取溶剂,根据脂肪(凝固点小于40℃)和激素在冷冻甲醇(-98℃)中的凝固点不同的原理,在冷的甲醇溶剂中于小于4℃的温度下冷冻离心去脂。
1.3净化
激素类药物受基质干扰严重,有效净化是测定的关键。一些较为特别的方法,如加速溶剂萃取(ASE)[18]、超临界流体萃取(SFE)[19]、免疫亲和色谱(IAC)[20]
、固相微萃取(SPME)[21]和分子印迹技术(MIPs)[22]等在激素残留中均得到了应用。卢杰等[23]将亚临界1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)的萃取技术应用于鱼肉中激素残留的前处理,整个亚临界萃取过程只需1h,有机溶剂用量仅为传统方法的十分之一,较传统的溶剂萃取法萃取效率高、操作简便、能同时完成萃取和分离、缩短了操作时间,且无环境污染。
虽然这些方法比较先进,但不适于常规大批量检测。基质固相分散(MSPD)对生物组织样品的处理较有效,但研磨的粒度大小和填装技术的差别可能会使淋洗曲线有所差异,方法不易标准化;IAC是目前净化和富集效能最强的前处理技术,但尚需进一步探索;SFE速度快、效率高、几乎不消耗溶剂,但装置价格昂贵;SPME纤维头易损坏,费用高。
目前应用较多的净化方法主要还是固相萃取、凝胶渗透色谱净化、基质固相分散和冷冻离心去脂等一种或多种方法的结合。
1.3.1固相萃取
很多文献报道采用C18小柱净化动物肌肉组织的基质提取液,HLB柱因具有较大的吸附容量和较宽的吸附范围已经基本取代了C18柱。
HLB柱也存在缺点:在处理大黄鱼、鳗鲡和动物肝肾等高脂肪含量的样品时易发生乳化现象,影响净化[24]。硅胶柱对于脂肪含量高的样品中弱极性化合物的净化效果比较好,在除脂的同时又能保证目标化合物的回收。
李向军等[24]采用硅胶柱对水产品中24种性激素进行了净化;康海宁等[25]利用硅胶柱对脂肪含量高、基质较肌肉样品复杂的动物肝肾样品进行了净化。
混合型强阳离子交换柱具有反相和阳离子交换功能,对于弱酸性质的激素具有较好的净化效果。蔡勤仁等[26]利用混合型强阳离子交换(MCX)柱净化猪组织样品,分析了12种类固醇激素。
1.3.2凝胶渗透色谱
采用激素的常规提取方式,目标物提取效率低、脂肪基质净化困难且步骤繁琐,凝胶渗透色谱基于分子大小原理可有效去除油脂和天然色素。研究者将用于农残净化的凝胶渗透色谱技术应用到兽药残留中,实现了同化激素与杂质的良好分离。孙汉文等[17]将样品用10mL乙酸乙酯-环己烷溶解后进凝胶渗透色谱(GPC)净化,于波长254nm处收集7.5~16.0min的馏分,再过HLB柱进一步净化,净化效果良好;谢维平等[27]将提取后的样品进入自制的LH-20凝胶色谱柱,以乙酸乙酯-甲醇-乙酸为流动相,收集20~35min的洗脱液进行净化。
GPC应用的关键是通过GPC色谱图找出恰当的切割时间点。由于GPC净化过程一般耗时长,因此较适用于多种同化激素的同时净化。
1.3.3基质固相分散
固相分散(SPD)和多重机制杂质吸附萃取净化技术(MAS)主要通过多种功能化吸附材料,将样品中可能存在的磷脂、脂肪和蛋白质等主要干扰杂质有效去除,同时又不吸附待测物质,可达到样品净化和富集的目的。该方法的优势在于快速、简便、对研究者的操作技能要求低,因而得到青睐。
MAS的关键是根据基质种类和待测物质的性质来选择合适种类和配比的吸附剂。所用的吸附剂主要包括N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18-封端)、石墨化碳黑吸附剂(GCB)、中性氧化铝、氨基功能化纳米吸附剂等。
PSA可去除提取液中的脂类和糖类物质,但对酸性化合物有一定的吸附作用;C18吸附剂可去除脂肪和非极性化合物,对极性较小的物质有一定的吸附;氨基功能化纳米吸附剂可有效吸附样品中的酸性化合物,去除脂肪酸、磷脂等干扰物质。
GCB可去除提取液中的色素,但对带有苯环官能团的化合物有较强的吸附作用。王美玲等[28]研究发现,GCB对激素类物质具有较大的吸附作用,通过在提取液乙腈中加入甲酸(0.1+99.9)溶液可减少PSA对酸性激素的吸附损失,C18吸附剂对激素的吸附不大,因此选择了一定比例的PSA、C18和硫酸镁为混合吸附剂,效果较好。姚姗姗等[29]在2mL溶液中加入0.1gC18、0.2g中性氧化铝和0.1g氨基功能化纳米吸附剂有效净化了鱼肉组织中11种同化激素,杂质信号下降至95%以上;张毅等[30]通过试验确定了以400mgPSA、50mgC18和600mg无水硫酸镁为混合吸附剂对谷物饲料中的41种激素进行净化提取,效果较好。赵永纲等[31]利用自制的氨基功能化四氧化三铁磁性高分子复合微粒(EDA-MPs)作为基质分散固相萃取吸附剂对牛蛙全血中6种酚类环境激素进行了净化。
2 样品的测定方法
2.1液相色谱条件
C18色谱柱应用最多。由于研究者测定的激素种类不同,流动相会有一些差别。高效液相结合质谱测定时,正离子模式一般采用甲酸-甲醇(0.1+99.9)混合液为流动相;负离子模式下,雌激素中性的甾体结构缺乏酸性或碱性基团,不易离子化,乙腈有利于化合物的去质子化,一般采用乙腈为流动相的有机相,水相则采用纯水或者添加一定氨水的水溶液,乙酸铵水溶液则不常用到。王美玲等[28]和张毅等[30]研究发现,水溶液中添加一定量的乙酸铵虽有助于化合物的色谱分离,但却使多数激素的离子化效率变低。赖世云等[32]以HSST3色谱柱梯度分离雄激素、孕激素、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮,用ShieldRP18柱分离雌激素,结合内标法测定了乳及乳制品中的29种性激素。
2.2串联质谱条件
由于分子结构的差异,雄激素、孕激素采用正离子源,电离形成[M+H]+准分子离子;雌激素采用负离子源,电离形成[M-H]-准分子离子;糖皮质激素类药物在正、负离子模式下均可电离成多种形式,其中[M+HCOO]-和[M+CH3COO]-准分子离子响应最大。尽管大气压化学电离源的响应灵敏度更高,但由于电喷雾离子源更易操作和维护,所以目前大多采用电喷雾离子源(ESI)测定同化激素。
也有研究采用大气压化学电离源(APCI),如李向军等[24]采用APCI同时测定了水产品中的24种性激素,以甲醇-水为流动相,雌激素的灵敏度较用ESI源提高了近20倍。
目前激素残留测定主要采用三重四极杆质谱,需要相应的标准品并建立LC-MS/MS分析方法,可对已知物质进行准确定量分析。而飞行时间和离子肼质谱等具有高分辨率和精确相对分子质量测量的特点,能提供未知化合物的结构信息,应用于激素分析中可精确定性痕量成分,从而扩大分析物种类,应急监测突发事件中的疑似物,是激素检测技术的发展趋势。
Touber等[33]利用液相色谱-飞行时间质谱技术测定了牛尿中40种同化激素和β-受体激动剂;蔡勤仁等[26]建立了猪组织中12种类固醇激素的液相色谱-四极杆/线性离子肼串联质谱(LC-Q/Trap-MS)结合谱库检索法。采用多级反应监测-信息相关采集-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)结合标准谱库检索的多步模式,将样品的EPI谱图与自己已建立的标准EPI谱图进行匹配,通过匹配值判断可疑样品。
12种激素的检出限为0.2~0.5μg·kg-1,测定下限为0.5~1.5μg·kg-1。
王和兴等[34]采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)实现了9种雌激素的快速基线分离和质谱母离子与特征性子离子的精确质量数测定,增强了复杂基质中雌激素的定性能力,检出限为0.11~0.3μg·kg-1,测定下限为0.37~1.0μg·kg-1。
张峰等[35]首次采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)测定了动物饲料中9种雄激素类药物。通过碰撞诱导解离模式(CID)得到各化合物碎片离子的精确质荷比,进一步对各化合物进行定性分析。各化合物的质量精确度均小于5×10-6。测定下限为10~43μg·kg-1,方法的定性准确度高,适用于饲料中禁用雄性激素药物的测定。
石先哲等[36]构建了在线微柱富集纳升液相色谱分析系统,结合纳喷离子源串联质谱法实现脑组织中10种类固醇激素的高灵敏检测。相同进样量下,方法的灵敏度比常规尺寸的液相色谱-质谱系统提高了57~714倍。流动相消耗量降低了几百倍,睾酮的检出限为20ng·L-1,实际测定中可测出大鼠脑组织中含量为0.06ng·g-1的皮质醇。
3 方法学验证
3.1基质效应及其消除
基质效应是指色谱分离时基质成分改变了待测组分的离子化效率而引起的信号增强或抑制。
LC-MS/MS普遍存在基质效应,影响测定结果精密度和准确度,尤其对于动物源等基质复杂的样品。基质效应采用(基质匹配标准溶液所作曲线的斜率/无基质标准溶液所作曲线的斜率-1)×100%进行评价。负值表示存在基质抑制效应,正值表示存在基质增强效应,绝对值越大则基质效应越强。消除基质效应的方法主要有同位素内标校正和空白基质配制标准曲线。
3.2检出限和测定下限
3.2.1液相色谱法谢维平等[27]采用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定了鱼肉中的5种激素类药物,测定下限在10~24μg·kg-1之间;刘宏程等[37]采用基质固相分散-高效液相色谱-紫外检测法分析了牛奶中的己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚,3种物质的检出限分别为4.0,4.0,6.0μg·kg-1,测定下限分别为10,10,20μg·kg-1。
3.2.2液相色谱-串联质谱法高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)测定激素的测定下限比HPLC降低了10倍以上。Dusi等[38]利用HLB固相萃取小柱结合LC-MS/MS分析了牛肝脏中9种糖皮质激素的含量,检出限为1.0μg·kg-1;Vanhaecke等[39]利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析了牛肌肉组织中的10种雌激素、10种促孕激素以及14种雄激素,涵盖了多种天然和人工合成的激素。肌肉样品微波萃取后用甲醇和正己烷除脂,乙醚液液萃取后过硅胶柱和氨基柱继续净化,样品的检出限为0.04~0.88μg·kg-1,测定下限为0.12~1.9μg·kg-1。
Yang等[6]测定了肌肉、牛奶和肝脏中50种同化激素,测定下限在0.04~2.0μg·kg-1之间。
HPLC-MS测定激素时,根据基质复杂程度、同时测定激素的种类、降低基质效应的方法以及不同的质谱分析器,测定下限各有不同,有的相差10倍或更多。根据现有文献,测定下限最低可达0.029μg·kg-1,最高不超过5μg·kg-1。
4 结语
同化激素因为脂溶性强的特点使得基质的净化非常重要。
HPLC-MS/MS是目前测定同化激素的主要方法,适合于一般的定量检测。而更先进的质谱分析仪器如高分辨四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱仪,四极杆离子阱(Q-Trap)等使得激素的研究朝着未知化合物的定性和结构分析方向发展。
参考文献:
[1]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002.
