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酶放大DNA电化学传感器的进展综述

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2015-01-22 共3952字
论文摘要

  生物传感器系将生物敏感物质转换检测方便的信号的器件[1],主要包括靶标识别元件和信号转换元件. 靶标识别元件是构建生物传感器的关键,必须对靶标有特异性与专一吸附或反应. 根据靶标识别元件的不同,生物传感器可分为酶传感器、免疫传感器、DNA 传感器等[2]. 信号转换元件是生物传感器的重要组成部分, 它对传感器的信号收集、运用、灵敏度等有极大的影响. 根据检测手段的不同,又分为质量敏感型、热敏型、场效应型、光学、电化学等传感器[3].

  DNA 电化学生物传感器以 DNA 为靶标识别元件,以电化学方法为检测手段[4],具有以下优点:

  1)DNA 可人工合成,成本低,易于保存;2)对检测对象,不仅可根据碱基互补配对的原则,检测特定序列的 DNA,还可利用适配体的特点,检测离子、小分子、多肽、蛋白质甚至细胞;3)用量少,易微型化;4)可联用多种检测方式,如质量型、光学、电化学等. 其中电化学传感器由于选择性好、灵敏度高、成本低、操作简便和易于微型化等而备受关注[5].

  酶是指具有生物催化功能的生物大分子,其催化效率很高, 对底物专一性好. 酶 DNA 电化学传感器响应快、操作简单,近年发展尤为迅速. 本文结合作者课题组的研究工作介绍酶放大 DNA电化学传感器的进展.

  1 蛋白质酶 ( 聚合酶 、 连接酶 、 内切酶、外切酶)

  脱氧核糖核酸 (DNA) 是生物遗传信息的载体, 其结构和功能对生物的遗传和变异有重要意义. 1953 年,Watson 和 Crick 提出了 DNA 的反向双螺旋结构,其两条 DNA 链对应的碱基 A-T 以双键形式连接,C-G 以三键形式连接, 糖-磷酸-糖主链在螺旋外侧, 配对碱基在螺旋内侧. 利用 DNA链之间碱基互补配对原则, 可实现特定序列的DNA 检测.

  聚合酶、连接酶、内切酶、外切酶等蛋白质酶对 DNA 底物有较好的特异性和高效的催化. 利用酶与 DNA 的作用设计的 DNA 电化学传感器已展现出强大的优越性和研究活力[6]. 通过聚合酶反应的放大作用[7],实现了目标物 (OTA)的超灵敏检测, 检测限达 6.5×10-11g·L-1. 利用 T4 连接酶将模板 DNA 首尾相接闭合成环并与引物 DNA 相结合,在 DNA 聚合酶的作用下,其引物可沿着环形模板不断扩增,达到滚环放大(RCA)形成多拷贝新链 DNA. 该 DNA 与通过 Au—S 键固定到金电极上的固定探针 DNA 杂交,从而可吸附更多电化学活性物质亚甲基蓝(MB).

  单一酶放大方法已可得到令人满意的检测效果, 通过有机耦合两种酶放大反应可得到更低的检测限. 鞠熀先课题组通过联用内切酶和聚合酶,实现了特定序列 DNA 的超灵敏检测(1.1×10-17mol·L-1)[8].

  他们将生物素标记的捕获 cDNA 固定于亲和素修饰电极. 在目标 tDNA 存在下,与辅助 aDNA 及 cDNA碱基互补杂交,形成了内切酶活性位点,通过内切酶的作用使目标 tDNA 循环利用, 导致了大量的RCA 引物序列的暴露.又经 RCA 反应形成的长链DNA 与量子点标记的探针 DNA 杂交, 实现了对目标 tDNA 的灵敏检测. 通常, 聚合酶和内切酶对DNA 的活性位点只针对某一序列, 这给设计通用型 DNA 电化学传感器增添了难度,在一定程度限制了其运用[9]. 外切酶可从核酸一端开始按序列顺序催化水解核酸磷脂键,对 DNA 序列无特定要求[10-11]. 2010 年,Plaxco 小组率先提出了利用外切酶III(Exo III)实现目标物循环放大的检测方法[12]. 随后报道用 Exo III 酶在电极上反应的灵敏检测各种物质,如 DNA[13-15]、离子(Hg2+)[10]、蛋白质[16]等. 作者课题组报道了 Exo III 酶放大的免标记通用型检测tDNA 方法[11]. 如图 1 所示,将形成突出 3′端的双链 DNA 探针通过 Au—S 键固定于金电极上,当tDNA 与双链 DNA 探针杂交时就可得到 Exo III活性位点(钝的 3′端双链),释放出的 tDNA 又可进行下一轮剪切,最终使含游离鸟嘌呤碱基(G)的探针被大量剪切, 使其减弱对电化学活性物质亚甲基蓝(MB)的吸附,实现 tDNA 的灵敏检测. 此法利用游离的 G 和 MB 的强烈特异作用, 免去了对探针的修饰,提高了灵敏度且降低了检测成本.

  2 酶联催化反应(辣根过氧化物酶)

  聚合酶、内切酶、外切酶等显示出强大信号放大能力,其作用底物为 DNA,通常需对 DNA 进行电化学活性物质的标记 (如二茂铁和亚甲基蓝).

  在分析过程中, 通过构型改变导致电化学活性物质与电极距离变化, 从而其电信号改变就可检测目标物. 但这种构型变化引发的电化学信号较弱,其应用受限. 酶联免疫分析法利用抗体、抗原的特异性结合酶催化作用, 实现蛋白质分析检测[17-18].

  该方法在核酸分析领域已引发关注[19-20].

  辣根过氧化物酶(HRP)系常用的标记蛋白质或 DNA 酶, 可催化氧化 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)形成蓝色氧化物,已广泛应用于比色传感领域[21]. 樊春海课题组[22]利用 HRP 具有催化氧化 TMB 的性能结合电化学的优势得到了 DNA的 fmol·L-1级别检测限. 他们将修饰 Biotin 和 Dig的分子信标(MB)固定于 Avidin 电极. 这种分子信标的结构阻碍了 Dig 与 Antidig-HRP 的结合. 当目标 tDNA 打开分子信标时,同时造成分子构型的改变, 促使暴露的 Dig 与 Antidig-HRP 结合, 得到HRP 氧化的 TMBOX的还原电流. 这种方法需分子信标修饰,增加了体系的复杂性和成本.作者课题组报道了用免标记的功能型分子信标检测特定序列的 tDNA[23]. 图 2 设计了含 SA 适配体序列的分子信标探针, 其位阻效应阻碍了适配体与 SA 的结合. 当目标物 tDNA 与探针相结合时,使适配体序列暴露于溶液中形成可与 SA-HRP紧密接触的结构,并测得 TMBOX还原电流,检测达到 pmol·L-1级别的 tDNA. 利用 SA 适配体与 SA的作用,可免去探针繁琐修饰,降低成本,取得优异的检测效果.

  3 脱氧核酶(8-17 DNA 酶)

  传统观点认为所有的酶均系蛋白质. 20 世纪80 年 代 初 ,Cech 和 Altman 发 现 了 核 酶 (Ri-bozyme)改变了这一看法[24], 随之人工合成筛选了有 RNA 切割和连接可催化形成肽键、磷酸化等能力的核酶. Breaker 小组也发现有同样催化能力的DNA 片段,即脱氧核酶 (DNA 酶 )[25]. 这一重大的发现为核酸分析领域提供了重要思路, 许多 DNA酶的检测方法已有报道.

  在 DNA 酶的催化反应, 常需金属离子作为辅酶因子. 因此,DNA 酶的生物传感器常用于金属离子的检测. 目前,已报道 Pb2+[26]、Hg2+[27]、Cu2+[28]、Mg2+[29]等作为辅酶因子的 DNA 酶. Pb2+作为 8-17 DNA酶的辅酶, 可激发酶的活性并能将一定结构的互1分析[30]. 在 Pb2+的存在下,8-17 DNA 酶活性被激发,切割其互补链,使修饰于 DNA 链两端的荧光基团和猝灭基团分离,实现了 Pb2+检测. Xiao 等[31]将 8-17 DNA 酶末端修饰电化学活性的亚甲基蓝并固定于电极上, 通过 Pb2+激发酶活性从而得到电流信号. 作者课题组报道了将 8-17 DNA 酶通过电化学发光(ECL)检测 Pb2+ [32]. 图 3 将氨基修饰的具有酶活性的 DNA 探针固定于活化羧基的玻碳基底, 加入功能核酸的底物 DNA 后, 在辅酶 Pb2+的作用下,8-17 DNA 酶将底物 DNA 切断, 使该8-17 DNA 酶通过碱基互补原则与修饰发光材料(Ru)的分子信标杂交,得到发光信号. 这种方法充分利用了 8-17 DNA 酶对底物 Pb2+的特异选择和碱基互补配对的原则, 实现了 Pb2+灵敏特异检测.

  过氧化物酶活性的 DNA 酶在生物分析领域的运用越来越受重视[33-35]. 这类 DNA 酶对核酸序列的要求不高, 一般能形成 G-四分体结构的均能与血红素(Hemin)相作用构成 DNA 酶. G-四分体结构的 DNA 酶有类似于辣根过氧化物酶活性,在H2O2存在下可使鲁米诺(Luminol)催化发光[36],也可 以 使 2,2′-连 氮-双 (3-乙 基 苯 并 噻 哩-6-磺 酸)(ABTS)[37-38]显色,已被广泛运用于比色传感器领域. Liu 等[13]将 G-四分体结构的 DNA 固定于电极,由于互补链 DNA 以其杂交屏蔽了其活性, 当目标在 tDNA 和 Exo III 的作用下,使其恢复催化活性,体现双酶的优势,实现 tDNA fmol·L-1级别的检测.

  4 DNA 电化学生物传感器的常见问题与解决方案

  国内外研究者一直致力于发展 DNA 电化学生物传感器,结合酶放大方法实现超灵敏、特异的目标物检测,已取得了很好的进展. 目前该方法存在的主要问题:1)电极选择:主要有玻碳电极和金电极. 玻碳电极需要较为复杂的预处理, 固定探针时其露出的羧基与修饰了氨基的探针需经较长时间的孵化[32]. 金电极主要是通过自组装,利用 Au—S键将探针固定于金电极上[11, 23];2)固定探针的浓度:

  不同的体系, 固定于电极上的探针浓度会极大地影响分析效果,浓度过高造成较大的排斥,降低其与目标物的接触效率,浓度太低则信号较弱. 目前主要根据不同体系经优化选取最佳的信噪比[10, 39];3)非特异性吸附:固定探针的同时需防止探针的非特异性吸附, 常用巯基己醇或氨基己醇. 在酶反应的过程中,金电极与酶吸附所造成的背景信号极大地影响其分析效果,通常可用 BSA 封闭金电极[23];4)杂交效率:非均相反应会不同程度地影响分析效果. Wang 课题组提出了三元单层结构组成的电化学传感界面,其中巯基己醇(MCH)使固定于电极表面 DNA 探针可直立于电极表面从而得到统一的构型,有利于杂交. 二硫苏糖醇(DTT)通过两个巯基固定于电极上, 其两个亲水羟基使 DNA 杂交传感器的杂交效率更高,分析效果更好[40-41].

  5 DNA 电化学传感器的发展趋势

  比表面积和导电效果均是影响电化学传感器分析效果的重要因素. 碳纳米管、石墨烯、金属纳米粒子等的修饰,结合 DNA 的识别作用越来越受到关注[42-43]. 纳米磁珠的富集能极大地提高信号 ,已被广泛报道[5]. 免标记的电化学方法简单、快速、方便,已受到极大的重视, 特异性好、灵敏度高的免标记 DNA 电化学生物传感器是今后的研究方向. 对此,作者在研究免标记 ATP 检测方面进行了一些尝试[44],研究结果进一步证明了免标记电化学检测的特点和应用潜力. 然而,DNA 电化学生物传感器常需将识别探针固定于电极上, 这种非均相反应使分析体系受到一定限制, 如固定探针过程繁琐、杂交效率低与非特异性吸附. 发展均相反应的 DNA 电化学传感器正日益受到重视.

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