摘 要： 目的：测定不同产地全蝎中多西环素的含量，研究该动物药材养殖过程中抗生素的使用情况。方法：使用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent C18(柱长250mm，柱内直径4.6mm,填料颗粒直径5μm)；流动相为醋酸铵溶液[0.15mol/L醋酸铵溶液-0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100:10:1)，用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈(83:17)；流速1.0ml/min;检测波长为280nm;柱温40℃；进样量10μl；共测定6个产地10批样品。结果：10批样品中，来自产地A的4批多西环素含量最高，为2.111-2.364mg/g；其次为产地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批无明显差异，含量在0.003-0.013mg/g之间。结论：本研究所用方法快速、准确、高效，为研究全蝎饲养中的抗生素添加提供了技术支持。
关键词 : 全蝎;高效液相色谱;多西环素;
Abstract： Objective: through determination of Doxycycline contents in Scorpio of different origins, to investigate antibiotic usage in raising animal TCM ingredient; Method: a High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method was introduce for content determination, the column was Agilent C18(column length 250 mm, inner diameter 4.6 mm, packed particle diameter 5μm), with a mobile phase containing Ammonium acetate solution[0.15 mol/L Ammonium acetate-0.01 mol/L Disodium Edetate-Triethylamine(100:10:1), pH adjusted to 8.5 by acetic acid)-acetonitrile(83:17), the flowrate was 1.0 ml/min, the detection wavelength was 280 nm, the column temperature was 40℃ and the injection volume was 10μl; 10 batches of samples from 6 different origins were analyzed; Result: in 10 batches of samples, 4 batches from origin A had highest Doxycycline content, which was 2.111-2.364 mg/g; the one next to it was 1 batch from origin F, the value was 0.873 mg/g; the rest 5 batches from B, C, E, F had no significant difference,and the value was 0.003-0.013 mg/g. Conclusion: the method used in this work was fast, accurate and efficient, providing technical support to the investigation of antibiotic addition in raising Scorpio.
Keyword： Scorpio; High Performance Liquid Chromatography; Doxycycline;
全蝎为《中国药典》收载的动物来源名贵药材，由于饲养环境特殊，为避免发生大规模病害、感染导致严重损失，部分养殖户可能在饲料中添加抗生素[1,2,3,4]。动物食用含抗生素的饲料后，体内残留的药物难以通过自然或人工方法清除，进而造成服用（包括外用）含全蝎类中药方剂的患者体内抗生素累积，影响患者身体健康。因此，目前对动物类药物、食品的质量控制研究中，常加入抗生素限量检查[5]。四环素类为广谱强效抗生素，文献报道显示，多种动物来源的药材、食品中，曾检出过上述药物。多西环素在四环素类抗生素中抗菌能力强，抗菌谱广，且较少报道过检出，因此具备一定的添加风险[6,7]。本研究拟收集多个产地多批全蝎样本，测定其中多西环素的含量，以研究该药物在动物来源药材饲养过程中的使用情况[8]。
1 、仪器和试药
1.1 、仪器
Agilent1200高效液相色谱仪，配备DAD检测器，自动进样器，四元高压泵和柱温箱（美国Agilent公司）；Mettler-Toledo电子天平（瑞士MettlerToledo公司）；ZW-800D全封闭智能匀浆仪（温州维科生物实验设备有限公司）；VM-D旋涡混合器（上海舍岩仪器有限公司）；Eppendorf 5506低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。
1.2、 试剂、试药和材料
多西环素对照品（批号：130485-201703）购自中国食品药品检定研究院；样品处理用乙醇为分析纯，购自广州化学试剂厂；色谱分析用乙腈、乙酸铵、三乙胺等为色谱纯，购自Sigma-Alderich；实验用水为Watsons纯净水；全蝎药材购自各地中药店，采取匿名随机编码，产地编为A、B、C、D、E、F，每个产地所取批次分别编为001、002，以此类推。
2、 方法和结果
2.1 、对照品配制
取多西环素对照品，精密称取约5mg，置于5ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解后，继续加50%乙醇定容至刻度，即得每ml含多西环素1mg的溶液，作为对照品溶液。
2.2 、供试品溶液制备
取全蝎样本2g，精密称定，加0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液匀浆后，转移至10ml量瓶中，再加入该溶液定容至10ml；吸取上述溶液1ml，置于另一10ml量瓶中，加50%乙醇稀释并定容至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。2.3含量测定方法色谱柱为Agilent C18(柱长250mm，柱内直径4.6mm,填料颗粒直径5μm);流动相为醋酸铵溶液[0.15mol/L醋酸铵溶液-0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100:10:1),用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈(83:17);流速1.0ml/min;检测波长为280nm;柱温40℃;进样量10μl；对照品和供试品色谱图见图1。
图1 对照品（50μg/ml）和供试品色谱图
2.4、 方法学考察
2.4.1、标准曲线和线性
取多西环素对照品溶液，精密吸取适量，置于多个5ml量瓶中，分别配制成浓度为1、5、10、20、50、100、200μg/ml的对照品溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，进行线性回归，求得回归方程为y=11.995x+3.7306(x为多西环素浓度，y为峰面积，r=0.99990）。结果表明方法所测结果在1-200μg/ml的浓度范围内呈线性关系，能够准确测定供试品中多西环素的含量。
2.4.2、 精密度实验
取供试品溶液，连续按“2.3”项下方法测定6次，记录多西环素峰面积，计算峰面积的RSD，结果显示，多西环素峰面积的RSD为0.69%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法精密度良好。
2.4.3、重复性考察
取全蝎样品（均来自产地A），按“2.2”项下方法平行配制6份供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量和含量的RSD，结果显示，多西环素含量的RSD为1.10%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法重复性良好。
2.4.4 、稳定性考察
取供试品溶液，置于自动进样器中，分别在放置后0、2、4、6、8、12小时按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量和含量的RSD，结果显示，多西环素含量的RSD为1.00%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法所制备样品在12小时内稳定性良好。
2.4.5 、回收率试验
取全蝎样品（产地A)1g，精密加入多西环素对照品溶液适量（表1），平行配制6份溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量、回收率和回收率的RSD，结果显示，多西环素平均回收率为97.67%,RSD为1.76%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法准确度良好。
表1 回收率测定结果（n=6)
2.5 不、同产地全蝎多西环素含量测定
取全蝎样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量。10批样品中，来自产地A的4批多西环素含量最高，为2.111-2.364mg/g；其次为产地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批无明显差异，含量在0.003-0.013mg/g之间（表2）。
表2 不同产地、批次多西环素含量测定结果（n=2)
3、 讨论
由不同产地多批次样品测定结果可知，全蝎在饲养过程中，不同程度存在抗生素添加。本研究所用方法虽然能够准确测定全蝎中添加的多西环素，但由于抗生素类药物种类繁多，很难在预先不了解药物添加种类的情况下，有针对性地进行相关检查和研究。为避免上述问题的出现，除继续加强信息收集和用药情况反馈外，可以使用更为精密和高灵敏度的仪器，如飞行时间质谱，通过将测定结果与化合物数据库信息进行比对和筛选，提高检测和限度检查的准确性。
参考文献
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