张本忠等分别采用大鼠、小鼠的胚胎肢芽细胞进行微团培养，观察到氟对肢芽细胞增殖和分化的影响，发现培养液中一定浓度的氟对大鼠与小鼠两种动物胚胎芽细胞的增殖和分化均有明显抑制作用，对肢芽细胞是属于特异性抑制剂，且呈现剂量 - 效应关系[20].李云等也有实验观察到将过量的氟化钠或甲基汞加入胚胎肢芽体外培养体系后，会对大鼠胚胎同样具有潜在的致畸性[21].砷有着多方面的临床治疗作用但有毒性，李勇等早在上世纪 90 年代末就已经在大鼠胚胎肢芽培养实验结果中发现其对肢芽细胞的 ID50和 IP50均随砷浓度的增高而减小，呈明显的量效关系，而且砷对肢芽细胞分化的影响要远大于对细胞增殖的影响，如砷浓度在 0.2mg/L 时，软骨细胞集落形成降低到正常对照组的一半以上，细胞增殖未受明显影响，但对大鼠肢芽细胞分化的抑制作用明显，甚至在砷不产生明显细胞毒作用的剂量下就能显着抑制细胞分化，这为最终断定砷为强致畸物提供了可靠证据[22].
现已证实镉和镍对动物均具有明显的发育毒性。金属镍几乎没有急性毒性，但羰基镍以蒸气形式可迅速由呼吸道、皮肤吸收则能产生毒性，这是作业环境中毒物侵入人体的主要途径。镉不是人体的必需元素，主要通过食物、水和空气从外界环境中吸取、进入体内蓄积的。罗欢等利用小鼠胚胎肢芽细胞微团培养法系统地观察了氯化镉、氯化镍单独作用及联合作用对肢芽细胞增殖和分化的影响，研究表明氯化镉、氯化镍分别单独作用时，均对胚胎肢芽细胞的增殖均有明显的抑制作用，当二者联合作用时对胚胎肢芽细胞的增殖和分化的抑制则表现为协同作用，即相加和加强作用[23].
2.3 食品添加剂对肢芽细胞增殖分化的影响
食品添加剂种类繁多，是当今食品工业生产中不可或缺的一大类物质，如果按照世界卫生组织及我国颁布的食品生产相关规定的剂量范围内使用，则属于安全使用。如果一旦偏离了标准（过量使用）或以有毒的相似物质替代以牟取暴利，将成为威胁人们食品安全的一大隐患。所以近年来人们针对食品添加剂的胚胎发育毒性、致畸性都倍加关注。逐渐开始使用肢芽细胞体外培养技术检测其发育毒性。如碱性橙Ⅱ（basic orange Ⅱ）是一种偶氮类碱性工业染料，常被一些不法商贩用来对豆腐皮、黄鱼等食品进行染色，如果过量摄取、吸入以及皮肤接触均会造成急性和慢性中毒，可严重危害了消费者身体健康。国内学者郑立心等采用微团培养技术研究碱性橙Ⅱ对 SD 大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响，结果为碱性橙Ⅱ对肢芽细胞的增殖毒性和分化有抑制作用，可能对大鼠胚胎具有潜在的发育毒性[24].盐酸克伦特罗（Clenbuterol,）是一种平喘药（β- 肾上腺素受体激动剂），近年来在畜牧生产中被用作饲料添加剂而大剂量使用，由于可明显提高瘦肉率，俗称为“瘦肉精”.但是盐酸克伦特罗的半衰期长，人食用残留有盐酸克伦特罗的肉制品后，由于在体内代谢缓慢，长期蓄积可出现多种有害效应与临床症状，甚至可能会影响孕妇母体健康及胎儿的发育。因此近年来其毒性及远期危害越来越引起人们的关注。梁晓芸等曾在 2005 年的研究中也已经证实了盐酸克伦特罗可明显抑制大鼠胚胎肢芽细胞增殖、分化的抑制，具有一定的胚胎毒性[25].因此，目前各国政府都已经禁止其用作肉用动物的饲料添加剂，规定在动物性食品中不得检出。
茴香精油具有抗氧化、抑菌及杀虫能力，在医药学领域及作为天然的食品添加剂（作为风味剂和防腐剂）等方面的应用前景巨大。国外近年有研究表明，在大鼠胚胎肢芽细胞培养液中加入浓度低至 0.93mg/ml 的茴香精油，就可引起肢芽细胞增殖抑制，但对细胞分化无明显影响。说明茴香精油可能会对胎儿的细胞有毒性作用，但是无致畸性[26,27].
2.4 物理因素对肢芽细胞增殖分化的影响
物理因素中磁场的强度对体外培养的胚胎肢芽细胞的增殖和分化是有影响的。如国内学者端礼荣等[28]应用大鼠肢芽细胞微团培养技术，发现稳恒磁场的强度对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化有影响，稳恒磁场的强度越大对其分化与增殖越抑制，呈强度 - 效应关系，从而证实对胚胎的发育产生危害。Guillaume 曾用 X- 射线辐射诱导培养的小鼠肢芽细胞结合瞬时转染技术，以评价 Tead3、集落刺激因子 1（Csf1）、P/Q 型钙通道α1 亚基基因（Cacna1a）三者在适应性反应中的作用，发现经 Tead3 和 Cacna1a 转染细胞凋亡水平明显高于未转染细胞。表明沉默的 tead3 和Cacna1a 能有效地终止肢芽细胞的适应性反应，且明确了 X-射线的致敏剂量是 0.3 Gy[29,30].
2.5 中药及植物雌激素对肢芽细胞增殖分化的影响
近年来、中草药、或含有植物雌激素的天然药物是否具有胚胎发育毒性不断引起人们关注，许多实验室采用了肢芽培养技术进行了大量的胚胎发育毒性检测。有国外学者已经发现[31],在小鼠肢芽培养液中加入 10μg/mL 剂量夹竹桃提取物的提取物能减少肢芽软骨形成但不影响骨化。
刘星等采用血清药理学方法给 SD 大鼠灌胃不同剂量的菟丝子水煎液剂，制备传统保胎中药菟丝子的含药血清，将其加入到采用悬浮培养法培养的大鼠胚胎肢芽器官的培养体系中，发现不同剂量的含药血清对肢芽软骨发育影响不同，培养后对大鼠前肢芽发育进行形态学评价（阿利新蓝染色、Neubert 评分），在加入中、低剂量组含药血清的实验组里，对肢芽发育无明显影响，但高剂量（大鼠灌胃量达 40g/kg BW 时制备的含药血清）对肢芽软骨的发育具有一定抑制作用。刘星等继续采用大鼠肢芽细胞体外培养法，发现不同剂量菟丝子含药血清均可促进肢芽细胞的增殖和分化、Ⅱ型胶原 mRNA 及蛋白的表达 ;而高剂量菟丝子含药血清可下调 BMP-2 mRNA 的表达水平，抑制肢芽细胞的分化[32,33].
肖杨[34]利用大鼠胚胎肢芽和中脑细胞微团培养模型研究染料木黄酮（GEN）的发育毒性，并探讨其发育毒性机制，认为木黄酮（GEN）为强致畸物，其致畸作用可能主要通过细胞毒性发挥作用，不依赖于雌激素受体途径。张勇[35]等则研究锌与金雀异黄素对软骨分化的影响，认为锌与金雀异黄素在一定浓度下能协同促进胚胎肢芽软骨细胞骨形态发生蛋白 -2（BMP-2）mRNA 及Ⅱ型胶原蛋白 mRNA的表达，以及降低 IL-6 的表达水平，促进发育中软骨面积的增加，具有刺激胚胎软骨发育分化的作用。
综上所述，目前在国内、外应用肢芽培养技术来研究微量元素对胚胎发育的影响、软骨与骨的发生机制、检测各种致畸因子的发育毒理及致畸机理已经比较普遍，有关生物学终点的检测方法和技术也日臻成熟，但在我国关于中药和食品添加剂的的安全性评价方面研究范围还比较局限。因此，应用动物胚胎肢芽培养技术（主要是大鼠、小鼠）对中药及各种制剂、各种提取的有效成分、中药含药血清的发育毒性与致畸机制研究、对各类食品添加剂的检测，特别是对天然、无毒类的食品添加剂的安全性评价和在食品工业生产中的开发应用均具有重要的意义。
参 考 文 献
[1]McQueen CA. In vitro toxicology model systems and methods[M].New Jersey :The Telford Press,INC,1989.3-267.
[2] 李勇，张天宝 . 发育毒理学研究方法和实验技术 [M]. 北京 :北京医科大学出版社，2000.87-89.
