摘 要： 雄蕊心皮化、雄蕊受损和花粉发育异常等多种因素都可以导致植物雄性不育，形成败育的花粉粒。综述了在雄性不育中植物花粉败育与呼吸作用、膜脂过氧化、物质代谢和小RNA等的关系。
关键词： 花粉败育; 呼吸作用; 膜脂过氧化; 物质代谢; 小RNA;
Abstract： Many factors, such as pistillody of stamens, damage of stamens and abnormal pollen development, can lead to male sterility in plants and the formation of abortive pollen grains. The relationship between pollen abortion and respiration,membrane lipid peroxidation, material metabolism and sRNA in male sterile plants was reviewed.
Keyword： pollen abortion; respiration; membrane lipid peroxidation; material metabolism; sRNA;
在对玉米、水稻、小麦和油菜的研究中都有雄性不育的报道[1,2,3,4]。雄蕊心皮化、雄蕊受损和花粉发育异常等多种因素都可以导致植物雄性不育，形成败育的花粉粒[5]。目前，基于大量的研究发现，导致花粉败育主要与线粒体的呼吸作用异常、膜脂过氧化、物质代谢紊乱和小RNA功能异常等有着密切的关联。
1、 植物花粉败育与呼吸作用的关系
在雄性不育系中，与呼吸过程有关的酶类活性普遍低于保持系，表明雄性不育系中花药的呼吸作用受到了抑制，使得能量平衡被打破，这是不育系的一个非常重要的特征[6]。周培疆等[7]在研究细胞质雄性不育系的花药发育过程中发现，与呼吸作用有关的酶（包括参与三羧酸循环的多种酶）的活性均低于可育系。在小孢子发育不同时期均观察到结构异常的线粒体，并且不育系的花粉中线粒体数量明显减少，内含物异常，不能行使正常代谢功能，最终导致花粉败育。线粒体是呼吸过程中至关重要的细胞器，为植物提供必要的生长、发育和繁殖所需要的能量。在大部分植物中线粒体是半自主的细胞器，携带着一定的遗传信息，且不同的物种间差异较大，植物的线粒体基因组在66～11.3 kb，不同种属间基因的排列顺序变化很大[8]。在植物线粒体基因组中含有许多同向和反向重复序列，在核基因的调控作用下，这些重复序列可以实现分子内和分子间的重组，产生大小不同的线粒体DNA，同时还存在高度可变的RNA编辑过程。线粒体基因组这些重复序列间的重组形成的异常嵌合基因和错误的RNA编辑可能是引起植物细胞质雄性不育的主要原因之一[9]。如芥菜雄性不育系hau CMS线粒体中的重复序列是其保持系的两倍，并且与雄性不育相关的基因orf288下游的3个大重复序列与该重复序列有关[10]。线粒体中缺少正确的RNA编辑会抑制DNA的转录过程，最终导致植物或细胞的死亡。转录后RNA编辑是线粒体基因调控非常普遍且重要的方式[11]。通常开花植物中线粒体基因转录后RNA编辑是将编码区中特定的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶（C-U)[12]。在细胞质雄性不育系中，育性恢复基因RF调节特异的RNA转录后编辑，通过切割或降解导致细胞质雄性不育的相关产物来恢复育性[13]。
2、 植物花粉败育与膜脂过氧化的关系
水稻中较高浓度H2O2的积累与膜脂过氧化的加剧是雄性不育的重要原因之一[14]。水稻不育系中SOD、POD、CAT等的活性低于保持系，这使得不育系小孢子中高浓度的H2O2无法及时清除[15]。在花椰菜雄性不育系的研究中发现活性氧清除酶的活性比保持系高，这可能是不育系通过清除体内过量的活性氧的一种自我保护反应[16]。2013年有研究发现在水稻中成功克隆的野败型细胞质雄性不育基因WA352是一个组成型表达的基因。WA352特异积累在花粉母细胞期的绒毡层与核基因编码且定位于线粒体的蛋白COX11进行互作。COX11具有消除活性氧的功能，可以抑制细胞程序性死亡。WA352与COX11互作干扰了活性氧的正常清除，绒毡层线粒体中积累了过量活性氧，同时诱导细胞程序化死亡（PCD）的细胞色素c释放到细胞浆，绒毡层提前启动PCD过程，这种与小孢子发育不同步的绒毡层异常降解可能是导致花粉败育的主要原因之一[17]。异常的绒毡层PCD过程，使得过氧化物酶的活性发生了异常，产生大量的H2O2无法及时正常清除，从而对蛋白质的合成起到了抑制作用。此时正值小孢子内生化反应最活跃，是核进行有丝分裂的时期，蛋白质的缺失最终致使核发育畸形，最终导致花粉败育[18]。
3 、植物花粉败育与物质代谢的关系
高等植物的小孢子沉浸在充满来自体细胞绒毡层的糖类和脂类的花粉囊中，花药发育早期大量的糖类被运输到花药中供其发育[19]。绒毡层细胞适时进入PCD过程，向花粉囊释放大量糖类、脂类和蛋白等营养和结构物质，以保证小孢子正常发育及成功授粉[20]。绒毡层作为物质运输和转运的中转站，对流入药室中的各种物质进行筛选，在绒毡层内部的酶系统可以将脂滴转化为糖类物质，也可以将糖类物质转化为脂滴，亦可以将多糖转化成单糖，这些重要的物质最终都运输给小孢子供其正常发育[21]。在花粉发育后期，花粉内会积累大量的淀粉，这为花粉的萌发储存能量，并且这也是花粉成熟的标志。因此，高等植物绒毡层细胞是否能够正常向花粉囊中释放糖类、脂类和蛋白质等，直接决定着花药内营养物质的积累、分配与花粉的育性。
3.1、 多糖积累与小孢子育性的关系
植物花药发育是一个以花粉为库的营养物质运输和转化的过程，最终在成熟花粉中积累大量的营养物质供其萌发时利用。在小麦花粉发育的早期，干旱胁迫导致花药中可溶性糖和蔗糖含量异常积累，最终导致花粉败育，推测蔗糖的水解过程受到抑制影响了花粉的育性[22]。细胞壁转化酶调节蔗糖的卸载，液泡转化酶调节碳水化合物的代谢过程[23]。在花药中干扰糖类的卸载和代谢能够抑制花粉的发育并引起雄性不育。在小麦水分胁迫引起的雄性不育系中，花药中高度表达的细胞壁转化酶基因IVR1和液泡转化酶基因IVR5都下调表达，这两个关键酶的功能缺失影响糖类的转运和代谢过程，可能是导致花粉败育的主要原因[24]。在水稻类似的研究中发现，特异性的在花药中表达的基因OSINV4，在冷胁迫下表达水平降低，该基因表达下调可能导致花粉粒中己糖产生和淀粉形成积累受到一定影响，最终导致花粉败育。耐寒品种中，OSINV4的表达不会因寒冷而降低，蔗糖不会在花药中积累，花粉粒中的淀粉形成也不受影响[25]。油菜中，通过反义抑制花药中特异表达的细胞壁转化酶基因Bncw INV2，导致花粉发育过程受到阻断、花粉败育[26]。在生理性雄性不育的研究中发现，可育1376自二核期开始，营养细胞中积累大量的淀粉颗粒，随着二核花粉中大液泡的消失和内容物的增加，至三核期花粉粒中充实着大量的淀粉颗粒，为花粉萌发储存能量。而（S)-1376提前降解的绒毡层过早地释放营养物质，致使在二核期以后，花粉不溶性多糖积累有限，最终致使花粉败育[27]。
3.2、 脂类的积累与小孢子育性的关系
脂类物质的合成一般有两种形式：一种是在质体中从头合成；另一种是内质网中脂肪酸的修饰，如不饱和化、羟基化、脂肪酸链的延长等[28]。在质体和脂质体中适当的脂类积累和花粉壁的正常形成呈正相关，参与脂肪代谢的基因突变会导致绒毡层形态异常和花粉外壁形成缺失[29]。不育系的四分体时期花粉母细胞分布较少的脂质颗粒，可能由于提前降解的绒毡层不能释放油脂和质体类物质，最终导致花粉败育[30]。绒毡层降解释放的大量孢粉素运至花粉母细胞外壁，形成形态规则、结构完整的球状花粉壁。小孢子外壁主要是由脂肪酸代谢物和酚醛酸高度聚合形成的孢粉素构成的[31]。在白菜核不育两用系中，小孢子时期的可育花药中绒毡层细胞将植物体内转运到花药中的多糖类物质转化为脂类物质供花粉吸收[32]。在水稻dpw突变体中，绒毡层和小孢子中无法特异性地形成正常功能的DPW蛋白，致使脂肪酸代谢发生紊乱，不能形成功能性的脂肪醇，花粉粒退化，花粉外壁不规则，花药发育异常[33]。
3.3、 蛋白质的积累与小孢子育性的关系
小孢子的整个发育过程具有一定的时序性，如果这种时序性被打断或扰乱就可能导致雄性不育[34]。蛋白质组学研究认为，细胞质雄性不育以及细胞核雄性不育中，植物雄性不育与某些重要的蛋白质的表达量的上调、下降、甚至缺失不表达，或者某些蛋白质的新增表达有关，这些重要的蛋白质分别参与了生物体内雄配子发育过程中各种物质代谢、DNA转录、信号转导、蛋白质合成、淀粉合成、细胞凋亡等重要生理过程[35]。赵海燕等[36]在棉花小孢子败育的研究中发现，在棉花不育系异常降解的绒毡层使得过氧化物酶的活性发生了紊乱。王泽立等[37]在玉米CMS-S恢复基因的研究中发现，双向电泳中某些特异性关键的蛋白质点的出现与消失，可能与玉米S型雄性不育的育性恢复有一定关系。在细胞质雄性不育的花药发育过程中，不育系的营养物质和重要的蛋白酶类物质随着花药败育过程的进行，其分解代谢逐渐增强而使得代谢紊乱，影响花粉的育性[38]。
花粉发育是一个复杂的过程，是多种代谢途径、信号通路等协调进行的，在这个过程中，细胞间的信号传导也起着非常重要的作用。许多转录因子，如在绒毡层和小孢子中特异表达的MYB80使得绒毡层异常降解而不能正常给小孢子提供营养物质导致雄性不育[39]。DEFECTIVE POLLEN WALL(DPW）是一个核基因编码脂肪代谢的脂酰还原酶，该基因主要在绒毡层和小孢子中特异表达，并且其编码的酶通过N端的一段信号肽定位在质体中，与其时空表达模式类似的基因CYP704B2的表达产物可能被定位在内质网上，主要功能是催化C16和C18脂肪酸的羟基化，其突变体dpw表现花粉外壁缺陷，导致小孢子败育[40]。大量的试验表明，绒毡层在小孢子正常发育过程中起着非常重要的作用。拟南芥中AtMYB103是绒毡层发生和形成正常小孢子所必须的基因，其突变体myb103绒毡层细胞提前降解，不能释放油脂和质体类物质。在AtMYB103的3′端融合了一个编码12个氨基酸一小段DNA，抑制AtMYB103的表达，将其转入拟南芥中，使得绒毡层提前降解，不能释放油脂和质体类物质，从而得到大部分植株为完全雄性不育系[41]。
水稻csa突变体中，花药绒毡层细胞在花药发育的后期降低了碳水化合物的水平，且引起雄性不育的同时下调编码单糖转运体基因MST8的表达[42]。花药中特异表达的TAZ1基因功能的丧失会引起矮牵牛绒毡层提前降解，并最终导致小孢子的提前退化败育[43]。绒毡层细胞的适时解体，可为小孢子的发育提供营养核结构物质以及发育所需要的空间，在花粉发育的整个过程中，为营养物质、结构物质的运输和转化，信号的正常传递等起关键性的作用。
4 、植物花粉败育与小RNA的关系
最近几年非编码RNA(nc RNAs）参与植物雄性不育被逐渐证明[44]。有研究表明，不同的作物可育系和不育系中miRNAs的表达是不同的，这些证据证明雄性不育系的形成与miRNAs异常有关[45]。深度测序和生物信息学的发展为深入研究nc RNAs参与植物雄性不育提供了更好更严谨的技术手段[46]。
4.1、 sRNA参与植物雄性不育
有研究表明，在拟南芥、番茄和芦笋中miR167家族参与生长素应答来调控雄性不育[47,48,49]。在拟南芥中过表达miR167导致雄性不育[50]。在白菜中一个编码PPR蛋白的基因bra027656，是miR158的靶基因。在过表达bra-miR158的转基因品系中，编码PPR蛋白的基因表达受到抑制，引起花粉代谢和花粉内壁发育缺陷，导致花粉萌发和花粉活力显着下降[51]。类似，有实验室在大豆中鉴定了包括gmamiR156、gma-miR160等一系列的miRNAs，这些miRNAs都抑制PPR蛋白的形成[52]。在拟南芥中过表达miR159能够延迟开花，miR159通过调节编码MYB转录因子的基因与花药发育有着非常广泛的关联。如，拟南芥中来自MYB转录因子家族的MYB103对花粉外壁的形成起着非常重要的作用，过表达miR159导致MYB103合成受到抑制，并且导致绒毡层提前降解，导致花粉败育[53]。在萝卜的不育系和保持系中，miR159的表达差异非常显着，试验中miR159转录本水平的升高降低了MYB101的表达，从而抑制了萝卜花药绒毡层的发育和外壁的形成[46]。在玉米中zma-miR601靶向调控与花形态建成和花粉发育有关的MADs-box转录因子家族的基因，还可能参与调控含黄素单氧化酶（FMO）和乙酰辅酶A水合酶（ECH）的基因，ECH在绒毡层脂肪酸代谢中必不可少。在细胞质雄性不育系的花药中上调miR601的表达量后导致ECH的表达水平降低，扰乱了脂肪酸代谢，导致绒毡层中能量不足，最终导致绒毡层细胞异常[54]。在芥菜生殖发育过程中，细胞质雄性不育系中ATP硫酰化酶1(APS1）的表达明显高于雄性可育系。与此同时，miR395的表达降低。进一步分析证实，在芥菜不育系中，APS1表达与miR395转录水平呈负相关[55]。
4.2、 lncRNAs参与植物雄性不育
在植物和动物的转录本中，有很大一部分包括200 nt长的未翻译RNA转录本，通常称为长非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs）。这些lnc RNAs分子具有多种生物学功能[56]。迄今为止，大多数lnc RNA研究都是在动物（包括人类）上进行的，而对植物的研究则较少。最初在植物中报道的一些具有生物学意义的lnc RNA，包括大豆[57]和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula)[58]中的GmENOD40和MtENOD40，并且已知它们调节结节的器官发生。也有报道表明植物开花和雄性不育也与lnc RNAs有关[59]。
有大量的研究表明lnc RNAs在雄配子体发育过程中上调表达。如，玉米lnc RNA(zm401）在雄性配子体发育和成熟花粉粒中表达非常丰富[60]。进一步研究证实，该表达模式对玉米雄性生殖发育具有特异性。并且推断zm401在调控花粉发育特异性基因MZm3-3、ZmMADS2和ZmC5的表达中起重要作用，zm401突变体绒毡层和小孢子发育异常，最终产生不育花粉[61]。在大白菜中克隆了一个具有花粉特异性表达的nc RNA(828 bp），标记为Brassica campestris Male Fertility 11(BcMF11）。通过反义RNA技术抑制BcMF11的活性，导致绒毡层解体异常、小孢子无细胞质等，最终导致小孢子败育[62]。
植物中基于lnc RNA调控基因表达的方式有以下几种：与RNA结合蛋白（nuclear speckle RNA-binding protein NSR）的相互作用调节可变性剪接；通过染色质重塑进行转录调控和mRNA的翻译水平调控；靶目标模仿机制；通过直接与目标RNA结合，形成双链lnc RNA-RNA，掩蔽剪接位点和信号[63,64,65]。
与miRNA相似，真核生物中的大多数lnc RNAs都是由RNA polⅡ转录的。植物中也有研究报道RNA polⅣ和RNA polⅤ也可以转录lnc RNAs，该类lncRNAs特异性地参与RNA介导的DNA甲基化过程[66]。在水稻中，LDMAR(Long-day-specific Male-fertility associated RNA）是长度为1 236 nt的lnc RNA，研究表明其参与调控水稻生殖发育，在长日照条件下，LDMAR的表达维持水稻花粉正常发育[67]。但是单碱基的突变改变LDMAR的二级结构，导致LDMAR的启动子区域的甲基化程度升高，LDMAR的表达量下降，花粉程序化死亡，最终导致光敏不育[68]。
5、 展望
本文综述了呼吸作用、膜脂过氧化、物质代谢和nc RNAs与植物花粉败育间的关系，对这些领域深入的研究将为作物育种和杂种优势利用提供更广阔的视野。呼吸作用和膜脂过氧化与植物雄性不育间的关系一直是热门的研究领域，最近几年越来越多的实验室开始关注绒毡层和nc RNA分子与雄性不育之间的联系。nc RNA对雄性不育的贡献仍有待发掘，破译nc RNA的工作机制将有助于更好地理解细胞质基因组与细胞核基因组之间的相互作用而导致的花粉不育。近年来，水稻中nc RNA与TGMS、PGMS的相关性研究为今后的研究提供了广阔的空间。同时，植物线粒体基因组中存在的nc RNA提供了基础去证明nc RNA与雄性不育间的联系。
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