上世纪80年代，北京、上海、广州率先开展新生儿两病筛查（先天性甲状腺功能减低症和苯丙酮尿症），后逐步推广到全国各地，新生儿疾病筛查逐步成为出生缺陷三级预防的重要手段。随着现代医学的发展，诊疗技术的提高，筛查的病种越来越多，医务人员对新生儿耳聋基因检测的认识也在逐步提高。我院在家长知情同意的情况下对2014-01-2015-03出生的9 421例新生儿进行耳聋基因检测，现报告如下。
1 资料与方法
1.1临床资料
2014-01-2015-03在石家庄市妇幼保健院出生的9 421例新生儿，其中男1例，女4 528例。
1.2方法
新生儿出生3d后采足跟血3滴，滴到专用滤纸片上自然晾干，每个血斑直径不得小于8mm.检测位点：所有新生儿均检测GJB2基因2位点（235delC和299-300delAT）、SLC26A4基因2位点（IVS7-2A>G和2168A>G）和 线 粒 体12SrRNA基因2位点（1555A>G和1494C>T）。基因组DNA的提取：
①待滤纸片上血滴晾干后，用打孔钳打下3mm血片放入1.5ml无菌离心管中。
②离心管中加入500μl灭菌双蒸水，振荡混匀后静置5min,12 000 r/min离心1min.
③吸弃上清，重复操作②1次。
④吸弃上清，加入DNA提取液200μl,100℃水浴8 min.
⑤12 000 r/min离 心5min,上清为DNA扩增模板。
1.3荧光PCR基因检测
应用济南英盛先天性耳聋基因检测试剂盒、迟发性耳聋基因检测试剂盒和药物性耳聋基因检测试剂盒，每个反应孔加入23μl相应检测位点反应液，2μl上述DNA扩增模板，于ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：50℃ 2 min,95℃2min,40循环95℃10s~61℃33s.
1.4结果判读
根据试验调节基线和阈值，Ct值<35视为有效扩增，在此基础上观察实时荧光曲线判读结果：FAM通道曲线呈“S”型增长判为野生型，HEX通道曲线呈“S”型增长判为纯合突变型，2条曲线同时呈“S”型增长判为杂合突变型，2条曲线同时不增长视为无效样本。
2 结果
9 421例新生儿中共发现突变携带者384例（男205例，女179例），6位点携带率为4.08%.其中158例（1.68%）携带235delC杂合突变，1例（0.01%）携带235delC纯合突变，55例（0.58%）携带299-300delAT杂合突变；133例（1.41%）携带IVS7-2A>G杂合突变，1例（0.01%）携带IVS7-2A>G纯合突变，19例（0.20%）携带2168A>G杂合突变；14例（0.15%）携带1555A>G均质突变，3例（0.03%）携带1555A>G异质突变。其中1例（0.01%）同时携带有235delC杂合突变，IVS7-2A>G杂 合 突 变 和1555A > G异 质 突 变，1例（0.01%）同时携带有235delC杂合突变，IVS7-2A>G杂合突变。
本研究中235delC位点杂合突变的新生儿中有1例右耳中耳炎伴有腭裂且右耳听力筛查未通过，经治疗康复后于3月龄时进行听力诊断为单侧中度耳聋；1例携带有235delC纯合突变的新生儿左耳未通过听力筛查；1例携带有IVS7-2A>G纯合突变的新生儿未通过听力筛查，于3月龄时进行听力诊断，CT结果示右耳前庭水管扩张，耳蜗发育不全；1例同时携带有235delC杂合突变、IVS7-2A>G杂合突变和1555A>G异质突变的新生儿和1例同时携带有235delC杂合突变、IVS7-2A>G杂合突变的新生儿均通过了听力筛查，并于6月龄回访时听力正常。见表1.耳聋基因突变者不论杂合突变还是纯合突变全部进行Sanger法基因测序验证，结果全部符合，部分测序图谱见图1.各突变位点占突变总数比例见表2.石家庄市耳聋基因热点位点突变率情况与周怡等〔1〕报道的北京市15 343例耳聋基因突变率比较，差异有统计学意义（P<0.01）.
3 讨论
3.1石家庄市新生儿耳聋基因检测的必要性
9 421例新生儿血片样本中共检出耳聋基因突变者384例，六位点携带率为4.08%,其中GJB2基因杂合或纯合突变214例（携带率为2.27%）,SLC26A4基 因 杂 合 或 纯 合 突 变153例 （携 带 率1.62%），线粒体12SrRNA基因均质或异质突变17例（携带率0.18%）。与周怡等〔1〕报道的北京市数据比较，发现石家庄市GJB2基因和SLC26A4基因的突变携带率高于北京市，mtDNA12SrRNA基因低于北京市；GJB2基因235delC位点、GJB2基因299-300delAT位点和SLC26A4基因IVS7-2A>G位 点依次高 出 北 京 市0.39%、0.18%和0.42%,SLC26A4基 因2168A>G位 点 和mtD-NA12SrRNA基因1494C>T位点的突变率与北京市持平，mtDNA12SrRNA基因1555A>T位点的突变率低于北京市0.12%,说明耳聋基因突变携带率存在地区差异，本研究数据可为当地临床诊疗及相关部门制定政策提供依据，当儿童听力筛查未通过时应考虑是否为基因突变所致，临床检测中可优先检测突变率高的位点，以提高检出率并根据检测结果有针对性地进行干预和治疗。有文献报道，先天 性 耳 聋 在 新 生 儿 期 的 发 病 率 为0.1% ~0.186%〔2〕,其中约60%是由遗传因素导致的〔3〕,所以在新生儿人群中开展耳聋基因热点位点检测非常有必要。
3.2特殊病例随访情况
本次筛查发现的5例特殊患者中有2例通过，家长反映新生儿对声音反应良好，这2例分别是不同基因的双杂合突变和多杂合突变，说明不同基因的不同位点突变之间不会产生累加效应。另一种情况是新生儿可能是迟发性或渐进性听力损失，家长自认为新生儿听力正常。建议家长应有足够的重视，定期检测新生儿听力情况，以免影响新生儿的语言发育。
3例未通过听力筛查的患者中，1例IVS7-2A>G纯合突变携带者确诊大前庭导水管综合征、耳蜗发育不全、重度耳聋，已佩戴助听器。该新生儿父母均为IVS7-2A>G杂合突变携带者，因此再次妊娠时应行产前耳聋基因诊断，以避免耳聋患儿的出生。
1例235delC杂合突变携带者右耳中耳炎、右耳听力筛查未通过且伴有腭裂，经治疗康复后于3月龄听力诊断为单侧中度耳聋，有研究表明GJB2基因的纯合突变与杂合突变听力损失程度有差别〔4〕,因此推测235delC杂合突变是其听力损失的原因，也不排除该新生儿在GJB2基因存在其他未能检测到的位点突变形成复合杂合突变导致听力下降的可能。
1例235delC纯合突变携带者出生3d时行听力筛查初筛，左耳未通过，生后42d未来复查，之后多次电话随访家长仍反映对声音反应良好。有文献报道，GJB2相关性耳聋在听力损失程度、始发年龄、两侧对称性、稳定性方面都具有多态性，一般为双耳同时受累，耳聋程度呈对称性，少数表现为不对称性，也有单耳受损的报道〔5〕.GJB2基因突变所致听力损害有的比较稳定，长期维持在一定的听力水平，有的表现为短期内急剧下降，有的表现为缓慢渐进性下降，或呈波动性下降〔6-7〕,也有可能单侧听力损失不易引起家长注意，所以该新生儿家长需提高警惕，定期检测新生儿听力。
3.3各突变位点占突变总数的比例
六 位 点 突 变 率 顺 位 排 序 依 次 为：GJB2235delC、SLC26A4 IVS7-2A > G、GJB2 299-300delAT、SLC26A4 2168A>G、mtDNA12SrRNA1555A> G、mtDNA12SrRNA 1494C> T,所 以GJB2 235delC和SLC26A4IVS7-2A>G成为石家庄市新生儿的热点突变位点。虽然目前耳聋基因检测成本较高，但是人们应重视其检测的重要性，本研究也可为当地各级部门制定出生缺陷相关政策提供数据参考。
综上所述，开展新生儿耳聋基因检测意义重大，遗传性耳聋的遗传方式多为常染色体隐性遗传或母系遗传，因此将耳聋基因检测纳入到婚检、孕产前检测中，对夫妇双方进行耳聋基因检测，将会更大程度降低生育聋儿的风险，这样可以把新生儿耳聋的三级预防提前到一、二级预防当中。因此各级政府应加大宣传力度，使得耳聋基因检测在三级预防中能够发挥更大作用。
参考文献
[1] 周怡，刘海红，郝津生，等.15 343例新生儿新生儿耳聋基因普遍筛查结果分析[J].中国听力语言康复科学杂志，2014,12（2）:109-112.
[2] 李倩.新生儿聋病易感基因筛查的研究进展[J].听力学及言语疾病杂志，2015,23（1）:91-96.
[3] 朱晓燕，魏钦俊，鲁雅洁，等.耳聋分子病因学检测与临床应用研究[J].南京医科大学学报（自然科学版），2013,33（2）:186-190.
[4]CRYNS K,ORZAN E,MURGIA A,et al.A geno-type-phenotype correlation for GJB2（connexin26）deafness[J].J Med Genet,2004,41:147-154.
[5] 欧阳治国，吴皓.GJB2基因突变及其听力损失特点[J].听力学及言语疾病杂志，2008,16（1）:72-74.
[6]DENOYELLE F,MARLIN S,WEIL D,et al.Clini-cal features of the prevalent form of childhood deaf-ness,DFNBl,due to a connexin-26gene defect:im-plications for genetic counseling[J].Lancet,1999,353:1298-1303.
