鼻咽癌是广西常见的恶性肿瘤之一，近年发病呈现逐年上升趋势，严重影响患者身体健康。因此，寻找有效的治疗方案和判断预后的生物学指标是目前临床研究者关注的一个热点。癌细胞转移是鼻咽癌基础研究和临床治疗的热点和难点，癌细胞如何通过淋巴管和微血管转移还存在争议[1,2].我们通过免疫组化检测方法了解 D2-40 蛋白和 CD34 蛋白均在鼻咽癌组织中表达情况，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1. 1 临床资料： 2007 年 2 月至 2010 年 8 月我科收治中晚期鼻咽癌患者 63 例，其中男 52 例，女 11 例，年龄22 ~ 6 岁，中位年龄 42 岁。观察组患者临床基本资料如性别、年龄、T 分期、N 分期、临床分期等与对照组相比较，差异无统计学意义（ P>0. 05） ,见表 1.
1. 1. 1 纳入标准： ①年龄 20 ~ 64 岁，性别不限； ②符合诊断标准，病理诊断为鼻咽部未分化非角化性癌，未使用抗癌药物治疗； ③临床分期Ⅲ、Ⅳ期； ④卡氏评分≥70 分； ⑤自愿参加并签署知情同意书。
1. 1. 2 排除标准： ①不符合纳入标准； ②癌细胞远处转移； ③合并其他严重感染者； ④研究期间使用其他抗肿瘤药物进行治疗； ⑤合并其他严重疾病如急性脑卒中、脑出血、精神病患者、肝肾功能严重损伤者。
1. 1. 3 剔除标准： ①患者治疗依从性差； ②患者治疗期间出现不良事件，经评估不适合继续参加研究； ③使用 rAd-p53 出现不耐受的不良反应。
1. 2 治疗方法
1. 2. 1 对照组： 仅给予同步放化疗，其中放射治疗操作及剂量为： 采用直线加速器对鼻咽部进行常规照射，放射总剂量控制在 70 ~76Gy,放射疗程为7 ~8 周，共进行35 次放射治疗，对于颈部转移的肿瘤病灶可将放射总剂量控制在60 ~70Gy.化疗操作及剂量： 一般采用卡铂+5-Fu 方案。卡铂剂量500mg/m2,一次给药，加入5%葡萄糖注射液250mL 中静脉滴注。5-Fu 剂量500mg/m2,每天1 次，加入5%葡萄糖注射液1000mL 中静脉缓慢滴注，总量5g 为一个疗程，与放疗同步进行，21d 后重复化疗1 次，共2 个周期。
1. 2. 2 观察组： 给予 rAd-p53 瘤内注射+同步放化疗，rAd-p53 使用方法：1 支（ 1×1012 病毒单位，中国深圳赛百诺公司生产，批号 S20080831） 使用生理盐水稀释 2mL 后在鼻内镜直视下进行鼻咽部多点原发病灶瘤体内注射，每周1 次，连用8 周。放化疗与对照组相同。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 微血管： 采用免疫组化 Elivision TM plus 二步法检测两组患者治疗前后原发病灶肿瘤组织中的CD34 蛋白和微血管 MVD 计数。检测所需的试剂盒（ 由福州迈新生物技术开发有限公司生产） DAB 显色试剂盒（ 北京中杉生物技术公司生产） ,CD34 蛋白抗体（ 北京中杉生物技术公司生产） .实验步骤： 经病理确认的标本用 4%甲醛固定，然后进行脱水，使用石蜡包埋技术处理，然后切片，采用 Elivision TM plus 二步法，按照试剂内置的说明书操作进行 CD34 蛋白检测。使用已知道的 CD34 蛋白阳性切片作为阳性对照，使用 PBS 代替阴性对照，进行切片确认。
1. 3. 2 淋巴管： 试验试剂： 免疫组化 ElivisionTM plus二步法试剂盒（ 由福州迈新生物技术开发有限公司生产） ,DAB 显色试剂盒（ 北京中杉生物技术公司生产） ,D2-40 单克隆抗（ 北京中杉生物技术公司生产） .实验步骤： 经病理确认的标本用 4% 甲醛固定，然后进行脱水，使用石蜡包埋技术处理，然后切片，采用 Elivi-sion TM plus 二步法，按照试剂内置的说明书操作进行D2-40 蛋白检测。
1. 4 结果判断
1. 4. 1 微血管： CD34-MVD: 采用 Weidner 方法，即先在 40 倍镜下选择高血管密度区（ 热点区） 计数，然后在 200 倍视野下计数被染成棕黄色的血管数目。
1. 4. 2 微淋巴管： D2-40 阳性表达于淋巴管内皮细胞胞膜和胞质，呈棕黄色颗粒。微淋巴管计数（ MLVD）方法采用 Weidner 法计数： 先在低倍镜下寻找新生脉管最密集的区域即热点（ hotspot） ,然后在高倍镜下对淋巴管进行计数，在肿瘤组织内以 5 个高倍镜视野脉管的平均数表示微淋巴管（ MLVD） .
1. 5 随访： 采用患者定期回院复查和由专门随访员电话进行随访，随访时间从 2007 年 10 月至 2012 年 3月，随访资料录入 epdata3. 1 数据库。
1. 6 统计学方法： 采用 SPSS19. 0 统计软件对整理的数据进行统计学分析，计量资料组间的比较采用 t 检验，计数资料组间比较采用 χ2检验分析，以 P<0. 05为显著性差异。
2 结 果
2. 1 D2-40 蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况： D2-40标记的淋巴管呈一致性的官腔结构，呈棕黄色染色，表现为一层薄壁，管腔内很少有淋巴细胞，无红细胞，见图 1.
2. 2 CD34 蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况： CD34 标记的微血管可见染色清晰的血管内皮细胞，呈棕黄色至深褐色弥散性分布，官腔大小不一，见图 2.
2. 3 两组患者治疗前后 D2-40 蛋白的表达情况的比较： 观察组患者治疗后鼻咽癌组织 D2-40 蛋白表达明显低于治疗前，差异有统计学意义（ P<0. 01） ; 对照组患者治疗前后 D2-40 蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05） ,见表 2.
2. 4 两组患者治疗前后 CD34 -MVD 表达情况的比较： 观察组 CD34-MVD 的表达较治疗前明显下降，差异有统计学意义（ P<0. 01） ; 对照组治疗前后鼻咽癌组织 CD34-MVD 的表达无明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05） 对照组，见表 3.
3 讨 论
鼻咽癌侵袭转移是一个复杂有序的过程，期间存在细胞粘附性下调、基质降解和迁移能力增强等多个关键环节，同时新生淋巴管和新生微血管提供肿瘤生长所需物质，并通过血液循环和淋巴循环将原发癌细胞输送到转移淋巴结和远处把器官。大量临床研究表明，鼻咽癌细胞主要通过淋巴系统进行扩散和转移，目前常见的淋巴管特异性标志物有肾小球足突细胞膜粘蛋白（ D2-40） 、血管内皮生长因子受体-3（ VEGFR-3） 等[3 ~5].近年来的研究表明，肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成。微血管密度（ MVD） 是目前检测鼻咽癌肿瘤血管形成的一个重要指标，检测抗 CD34抗体标记的微血管密度是判断肿瘤复发和转移的有效指标[6].
本研究结果显示，D2-40 蛋白和 CD34 蛋白均在鼻咽癌组织中表达，提示我们根据这些指标的变化可以评估鼻咽癌的治疗效果。江河等[7]人研究结果示，D2-40 与癌组织远处转移有关，D2 - 40 蛋白表达降低，MLVD 数量下降，远处转移风险低。周日晶等[8]人研究结果显示，鼻咽癌患者 CD34 蛋白表达降低，MVD数量下降，降低了癌组织向远处转移的风险。研究也显示，在治疗前后的比较研究中，观察组患者 D2-40蛋白表达下降明显，而对照组无明显变化，提示我们rAd-p53 瘤内注射+同步放化疗效果明显优于单纯同步放化疗，观察组患者 D2-40 蛋白表达低，说明该治疗方案能明显抑制癌组织淋巴内皮细胞和淋巴管生成。另外，研究结果也显示，观察组 CD34-MVD 的表达较治疗前明显下降，而对照组 CD34-MVD 的表达治疗前后无明显下降。提示我们 rAd-p53 瘤内注射+同步放化疗方案不仅能抑制淋巴内皮细胞及淋巴管生成，同时也能抑制癌组织微血管的形成，研究文献亦证实本研究结果。
参考文献：
[1] Beddy D,Hyland JM,Winter DC,et al. A simplified tumorregression grade correlates with survival in locally advancedrectal carcinoma treated with neoadjuvant chemoradiotherapy[J]. Ann Surg Oncol,2008,15（ 12） :3471 ~3477.
[2] 陈闯 谭晓虹，岑洪，等。 鼻咽癌组织中微淋巴管和微血管密度的观察及其临床意义[J]. 重庆医学，2012,（ 16） :1582 ~ 1584.
[3] 李菊兰，蔡华成，黎志强，等。 血管内皮生长因子和微血管密度在鼻咽癌组织中的表达[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科，2009,16（ 12） :702.
[4] Xu XR,Wang BR,Zhang Y,et al. Radiotherapeutic treat-ment of a fighter pilot with nasopharyngeal carcinoma[J].Aviat Space Environ Med,2014,85（ 10） : 1056 ~ 1060.
[5] Foote RL,Weidner N,Harris J. Evaluation of tumor angio-genesis measured with microvessel density （ MVD ） as aprognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma: results ofRTOG 9505[J]. Int Radiat Oncol Biol Phys,2005,1 （ 3） :745 ~ 753.
[6] 倪昊生，倪炳华，刘益飞。 鼻咽癌组织中 VEGF、Ang-2、MVD 的表达及意义[J]. 江苏医药，2011,37（ 21） : 2521 ~2523.
[7] 江河，兰桂萍，翁敬锦，等。 淋巴管标记物 Podoplanin、D2-40 在鼻咽癌组织中的表达及临床意义[J]. 医药前沿，2012,32（ 11） : 60 ~ 61.
