2. 2 拉长细管。
拉长细管主要分为 2 种，一种是开放的拉长细管，一种是封闭的拉长细管。OPS 法是将细管加热后拉长变细，管壁变薄，这样细管容积变小，装载微量冷冻液即可完成冷冻保存过程，极大提高了冷冻速度，其降温速率能达到20 000℃ /min 以上[11].
OPS 技术是为超快速玻璃化冷冻技术设计的专用工具，在卵母细胞和胚胎冷冻方面迅速得到推广应用，卵母细胞冷冻效率不仅得到较大提高，而且解冻后的卵母细胞质量较常规细管法明显增强[12].OPS法由于具有虹吸作用，卵母细胞的装载时间相对缩短，与常规细管法相比不仅提高了冷冻和解冻的速度，同时减少了透明带的损伤和渗透损伤[13].CPS法与 OPS 法相似，研究表明，二者冷冻效率也没有较大差异[14,15].GMP 法是在 OPS 法的原理上衍生而来的，只不过是将塑料吸管换成玻璃毛细管，由于其内径较小，同样长度的玻璃毛细管拉长后容积约为OPS 管的1 /19,因此，GMP 法比 OPS 法具有更快的冷冻速率，且由于比重较大不会漂浮在液氮中[16].
2. 3 冷冻环。
冷冻环是直径0. 5mm ~ 0. 7mm 的尼龙环，冷冻卵母细胞之前，在冷冻环上用冷冻液制作一层薄膜，然后将卵母细胞小心移到冷冻液薄膜上，这个过程较为精细，要求尽量减少冷冻液的同时将卵母细胞放置在薄膜上，然后迅速投入液氮中[17].由于没有细管等的隔离，而且冷冻液量少，冷冻解冻过程中温度变化速度既迅速又均匀，能够有效减少细胞的机械和渗透损伤[18].如果长期保存卵母细胞，可以将冷冻环插入带有磁性的冷冻帽上，放入液氮预冷的配套冷冻管中，这个冷冻管开口端带有铁圈，能够有力吸住磁性冷冻帽，而且冷冻管底部有透气孔，利于液氮迅速进入冷冻管。冷冻环法较之 OPS 法所需冷冻液更少，因此冷冻速率更快，其冷冻效果更佳[19].
3 抗冻保护剂。
抗冻保护剂是在冷冻液中添加的主要为了防止细胞冷冻损伤的物质，主要分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂 2 种。渗透性保护剂主要有乙二醇、甘油、丙二醇、二甲基亚砜、丁二醇、乙酰胺等。这类抗冻保护剂能够使细胞迅速脱水，同时能够降低冷冻液的凝固点，从而减少细胞内形成冰晶而造成对各种细胞器机械损伤[20].非渗透性保护剂主要包括葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等小分子量糖类，同时也包括大分子量的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、聚乙二醇等物质。这类抗冻保护剂能够增加并稳定细胞外冷冻液的渗透压，从而在外部达到细胞脱水目的的同时降低渗透损伤，并且可以降低渗透性抗冻保护剂的浓度，减少毒性损伤[21].
在众多抗冻保护剂中，最常用的主要是甘油、二甲基亚砜、蔗糖、海藻糖等物质。海藻糖是由 2 个葡萄糖分子以 1,1 - 糖苷键构成的非还原性糖，在冷冻液中添加后由于其热稳定性好而使玻璃化效果温域增长，同时对卵母细胞的渗透保护作用被人们广泛接受，应用较为广泛[22].
4 卵母细胞体积调控。
在卵母细胞玻璃化冻融过程中，由于细胞内、外渗透压差的存在，会造成卵母细胞因快速脱水或充水体积急剧皱缩或膨胀，从而导致卵母细胞的透明带断裂、纺锤体失常、细胞骨架损伤、功能分子平衡破坏等[23].卵母细胞在冻融过程中受渗透压影响而体积变化后，渗透压调节分子通道会被激活，通过提高细胞内无机离子和有机渗透压而调节细胞内部分子的浓度，使卵母细胞达到正常体积[24].近年来，通过调控卵母细胞体积、减少冻融过程中的渗透损伤来提高其冷冻效率的研究日益受到关注。
Moawad 等[25]在解冻后的胚胎培养液中添加渗透压调节分子 L - 胆碱，显着提高了小鼠卵母细胞冻融后的体外受精率和胚胎体外发育率，说明渗透压对卵母细胞的影响不仅存在于冻融过程中，其调节作用至少能够持续到解冻后受精及其后的胚胎发育阶段。
5 展望。
近年来，卵母细胞冷冻保存技术研究虽然得到了很大的进展，但是仍然难以摆脱渗透性抗冻保护剂细胞毒性的困扰，在冷冻载体上难以达到量产推广的程度，冻融后的卵母细胞发育潜力还有提高的空间。相信在不久的将来，细胞体积调控理论能够得到丰富，更多的渗透调节物质能够被开发应用为抗冻保护剂，卵母细胞冷冻保存效率会得到进一步提高，从而为人类生殖医学、胚胎生物工程和动物种质资源保存提供有力支撑和巨大的推动作用。
参 考 文 献
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[3]FUKU E,KOJIMA T,SHIOYA Y,et al. In vitro fertilizationand development of frozen - thawed bovine oocytes[J].Cryobiology,1992,29（ 4） : 485 - 492.
